Hodnotenie genetickej premenlivosti

Fenotypový znak =

dedičné vlohy +

vplyv prostredia

Markér =

fenotypový znak, ktorý nie je ovplyvnený

prostredím, t.j. je výlučne kontrolovaný

geneticky

Markéry
• morfologické

• chlorofylové mutanty
• farebné varianty
• tvarové varianty

• biochemické

• monoterpény

• molekulárne

• proteínové
• DNA

Proteínové markéry

• krvné skupiny
• zásobné proteíny (SDS-PAGE)
• izoenzýmy

–

+

homogenizácia
pletiva

elektroforéza

histochemické
farbenie

škrobový alebo
polyakrylamidový
gél

Nástroje analýzy DNA

• restrikčná analýza
• PCR

Restrikčné endonukleázy
Typ I

vyhľadávajú sekvenciu
strihajú náhodne

Typ II

vyhľadávajú sekvenciu
strihajú v jej rámci

Typ III

vyhľadávajú sekvenciu
strihajú vo vzdialenosti cca
20 –25 báz

Restrikčné endonukleázy

Vytvárajúce hladký koniec (blunt end)

Sma I

CCC↓GGG
GGG↓CCC

Vytvárajúce previs (overhang, sticky end)

Xma I

C↓CCGGG
GGGCC↓C

Dĺžka vyhľadávanej sekvencie

4 bp

(Ř dĺžka fragmentov 256 bp)

6 bp

(Ř dĺžka fragmentov 4096 bp)

8 bp

(Ř dĺžka fragmentov 65536 bp)

3’

3’

5’

5’

Polymerase Chain Reaction; PCR

3’

3’

5’

5’

94 °C

1. cyklus
denaturácia (denaturation)

3’

3’

5’

5’

50 °C

1. cyklus
pripojenie primerov (annealing)

16 bp ≈ 416 = 4.29 . 109 kombinácií

3’

3’

5’

5’

72 °C

Taq polymeráza
voľné nukleotidy (dNTP)
Mg2+

1. cyklus
syntéza druhého reťazca (extension)

3’

3’

5’

5’

95 °C

2. cyklus
denaturácia (denaturation)

3’

3’

5’

5’

50 °C

2. cyklus
pripojenie primerov (annealing)

3’

3’

5’

5’

72 °C

2. cyklus
syntéza druhého reťazca (extension)

3’

3’

5’

5’

Izolovaná DNA

1.cyklus

2.cyklus

3.cyklus

denaturácia

pripojenie primerov

elongácia

95 °C

~50 °C

72 °C

95 °C

~50 °C

72 °C

95 °C

~50 °C

72 °C

atď.

PCR

Restriction Fragment Length
Polymorphisms; RFLP

• strihanie restrikčnými endonukleázami
• elektroforéza
• denaturácia
• prenos denaturovanej DNA na membránu
(nylon, nitrocelulóza)
• Southernova hybridizácia s rádioaktívne
značenou próbou
• autoradiografia

Restriction Fragment Length
Polymorphism; RFLP

výhody

• vysoko polymorfné markéry
• spravidla kodominantné
• možnosť analýzy veľkého počtu lokusov
• reprodukovateľná metóda

nevýhody

• pracnosť
• používanie rádioaktívnych izotopov

PCR-RFLP cyDNA

• amplifikácia fragmentov cpDNA alebo
mtDNA pomocou PCR
• štiepenie amplifikovaných fragmentov
endonukleázou
• elektroforéza

Mikrosatelity (Simple Sequence
Repeats; SSR)

1–6 bp
P1 ....CGTATATATATATGGCA...

....GCATATATATATACCGT...P2

P1 ....CGTATATATATATATGGCA...

....GCATATATATATATACCGT...P2

Výhody

• v jadrovom aj cytoplazmatickom genóme
• vysoko variabilné, kodominantné, nekódujúce
• PCR, reprodukovateľné

Nevýhody

• finančne a technicky náročná iniciálna identifikácia
• nulové alely, homoplázia

Minisatelity (Variable Number of
Tandem Repeats; VNTR)

9–40 bp, bohaté na GC
hlavne v oblasti centroméry a telomér
hypervariabilné, nekódujúce

RFLP

fingerprinting
mapovanie genómu

Randomly Amplified Polymorphic DNA;

RAPD

Amplifikácia náhodných fragmentov

Primery ~10 bp

Teplota pre annealing cca 36 °C

Výhody

• rýchla, lacná, jednoduchá metóda

• nevyžaduje znalosť sekvencií

• rýchla identifikácia veľkého počtu lokusov

Nevýhody

• dominantné markéry

• nízka reprodukovateľnosť

• homoplázia

• neznámy pôvod fragmentov z genómu (n, cp, mt)

Amplified Fragment Length Polymorphism;

AFLP

Amplifikácia náhodných fragmentov

• štiepenie restrikčnými enzýmami,vytvárajúcimi

previs (často + zriedkavo strihajúci)

• ligácia adaptérov so známou sekvenciou

• PCR s primermi = adaptér + previs

Výhody

• viac fragmentov

• nevyžaduje znalosť sekvencií

• vyššia reprodukovateľnosť v porovnaní s RAPD

Nevýhody

• dominantné markéry

• technicky náročná metóda

• patentová ochrana

Možná konverzia RAPD a AFLP na

Sequence-Characterized Amplified

Regions (SCAR)

• izolácia fragmentu z gélu

• sekvenovanie

• design fragmentovo-špecifických primerov

Single Strand Conformation Polymorphisms;

SSCP

• amplifikácia jednoreťazcových fragmentov

asymetrickou PCR (nadbytok jedného primeru)

• denaturácia 5 min 55 °C

• elektroforéza pri konštantnej teplote

Výhody

• kodominantné markéry

• veľký počet lokusov

• možnosť automatizácie

Nevýhody

• bialelické markéry

• polymorfizmus často špecifický pre populáciu

• technicky náročné

Sekvenovanie DNA

• PCR s rádioaktívne značenými

2´3´-dideoxynukleotidmi

• elektroforéza

• autoradiografia

• PCR s neznačenými 2´3´-dideoxynukleotidmi

• elektroforéza

• farbenie striebrom

• PCR s fluorescenčne značenými

2´3´-dideoxynukleotidmi

• elektroforéza v automatickom sekvenátore

• vybudenie farbiva laserom

báza

O

CH

2O

1´

2´

3´

4´

5´

-PO

3

–

nukleotid

×

Sekvenovanie DNA

• PCR s rádioaktívne značenými

2´3´-dideoxynukleotidmi

• elektroforéza

• autoradiografia

• PCR s neznačenými 2´3´-dideoxynukleotidmi

• elektroforéza

• farbenie striebrom

• PCR s fluorescenčne značenými

2´3´-dideoxynukleotidmi

• elektroforéza v automatickom sekvenátore

• vybudenie farbiva laserom

Expressed Sequence Tag

Polymorphisms; ESTP

• izolácia mRNA

• reverzná transkripcia – syntéza cDNA

(AMV-RT, MMLV-RT)

• RT-PCR (Tth, Tfl)

• sekvenovanie

• identifikácia homologických génov v databankách

• určenie špecifických sekvencií primerov

hodnotenie premenlivosti exprimovaných génov

Charakteristiky genetickej
premenlivosti

Genetická premenlivosť

• genetická multiplicita

• alelická
• genotypová

• genetická diverzita
• genetická diferenciácia

Genetická multiplicita
miera počtu typov (genotypov resp. alel)
nájdených v populácii

• podiel polymorfných lokusov

• priemerný počet alel (genotypov) na lokus

• prepočet na rovnakú veľkosť výberovej vzorky
(rarefaction)

g – štandardná vzorka
N – aktuálna veľkosť vzorky
Ni – počet exemplárov i. alely vo vzorke

Genetická multiplicita Fagys sylvatica/F. orientalis

(rarefaction)

Population

N

A

A

[20]

PP

H

O

H

E

F

Picea omorika

Višegrad Veliki Stolac
Višegrad Gostilja
Višegrad Karaula Štula
Višegrad Božurevac
Višegrad Tovarnica
Rogatica Novo Brdo
Rogatica Panjak
Srebrenica Šarena Bukva
Srebrenica Strugovi
Srebrenica Pliština
Čajniće
Foča
Kakanja

average of natural populations
pooled natural populations

29.4
20.7
69.4
33.8
31.8
30.7
31.3
52.9
21.9
10.6
25.5
42.5
28.6

33.7
400.5

19
19
21
19
18
21
19
21
20
18
20
19
23

19.6
24

18.81
18.87
20.26
18.93
17.99
20.53
19.00
18.32
19.72
18.00
19.93
18.99
21.51

19.11
20.42
22.24b

18.8
18.8
25.0
18.8
12.5
25.0
18.8
31.3
25.0
12.5
25.0
18.8
37.5

20.9
43.8

0.060
0.044
0.107
0.111
0.058
0.100
0.132
0.018
0.047
0.024
0.096
0.074
0.070

0.073
0.075

0.047
0.055
0.096
0.072
0.046
0.085
0.083
0.017
0.082
0.046
0.092
0.081
0.093

0.067
0.088

-0.273*
0.204
-0.050
-0.546**
-0.259*
-0.182*
-0.605**
-0.357**
0.437**
0.494**
-0.041
0.082
0.249**

-0.112c
0.125d

Picea abies

Poľana

200.0

42

24.78
42.00b

81.3

0.146

0.140

-0.043

N – average sample size, A – total observed number of alleles, A

[20], A[400] – allelic richness (total number

of alleles after the rarefaction to a common sample size of 20 and 400 gene copies, respectively),
PP – proportion of polymorphic loci, H

O – observed heterozygosity, HE – expected heterozygosity, F – fixation index

a

artificial plantation, b A

[400] , significance levels: * – P < 0.05, ** – P < 0.01,

c

F

IS,

d

F

IT (Wright 1965)

Genetická diverzita
miera počtu typov nájdených v populácii pri zohľadnení
ich frekvencií

diverzita = multiplicita × vyrovnanosť (evenness)

• „efektívny“ počet alel:

n

v

p

e

i







2

2

1

'

1

lim

H

i

i

e







Genetická diverzita

• „očakávaná“ heterozygotnosť (expected heterozygosity
gene diversity Nei 1973)

nestranný odhad pri veľkosti vzorky n jedincov

• pozorovaná heterozygotnosť ho = ΣP

ij,

kdeP

ij je frekvencia genotypu AiAj i ≠ j

• podmienená heterozygotnosť (conditional heterozygosity
Hattemer et al. 1993): H

c = Ho/Hmax.

H

max=2(1–pi(max)) pre pi(max) > 0.5,

H

max = 1 pre pi(max) ≤ 0.5

h

p

e

i

 



1

2





h

n

p

n

e

i









2 1

2

1

2 / (

)

Kategória

n

a

n

e

h

e

Nahosemenné
Krytosemenné

Endemity
Lokálny areál
Regionálny areál
Rozšírené druhy

Boreálne druhy
Druhy mierneho pásma
Tropické druhy

2,38
2,10

1,82
2,08
1,87
2,11

2,58
2,27
1,87

1,22
1,26

1,09
1,22
1,23
1,39

1,28
1,22
1,28

0,169
0,183

0,078
0,165
0,169
0,257

0,206
0,166
0,191

Charakteristiky vnútropopulačnej genetickej premenlivosti

Genetická diferenciácia

Genetická vzdialenosť – miera rozdielu v zastúpení genetických
typov medzi dvomi populáciami (jedincami)

Nei 1978:

Gregorius 1974















i

i

xy

i

i

y

x

y

x

xy

y

x

J

y

x

J

J

n

n

J

J

J

D

);

(

)

(

;

1

2

2

)

/

ln(

2

2

|

|

2

/

1

0

i

i

y

x

d







Tanimoto (Sneath a Sokal 1973):

)

(

)

(

1

Y

X

N

Y

X

N

D

T









Genetické vzdialenosti medzi druhmi rodu Pinus subsekcia Sylvestres a
geografickými rasami v rámci Pinus sylvestris
Druh

1

2

3

4

1

P. sylvestris

****

0.108

0.148

0.161

2

P. mugo

****

0.161

0.172

3

P. funebris

****

0.158

4

P. pallasiana

****

Rasa (P. sylvestris)

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.1

sylvestris ****

0.003

0.005

0.010

0.021

1.2

cretacea

****

0.004

0.010

0.019

1.3

lapponica

****

0.009

0.018

1.4

sibirica

****

0.031

1.5

hamata

****

States

Region

CH, D

Jura/Schwarzwald •••

•••

UKR

Podol’e

••• •

•

CZ, SK, PL, HU

•• •

• ••

UKR, RO, SLO, HR

•• •••••

••••• •

IT

••• • •

• • •••••••

BiH, YU

Central Dinar.

••• • • •

• • •

CH

West Alps

•••••• • •

• •

MOLD

Moldova

•••••• • •

• • •

IT

Calabria

••• •••• ••••••••••••••••••

•• • • •

BG, YU

Stara Planina

• •• • • •

•••••• • •

BG, GR

Rodopy

• • • •

• • •

FYROM, GR, BG South Dinar.

•••• • •••••••••

• • •

UKR

Crimea

••••••••••••••• • •

• •

BG, TR

Thrakia

••• • •

••••••••• • ••••••••••••••••••••

TR

West Asia Mi

••• •••••••••••••••••••••• • •

• • •

TR

East Asia Mi

••••••••••• • •

• ••••

Russia

West Grand Cauc ••••••••••••••••• • • •

•••••••••••••••••••••••• • •

Azerbaidzhan

East Grand Cauc

••••••••••••••••• • •

• •

Armenia

Small Caucasus

••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• •

•

Iran

Alborz

••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

Fagus sylvatica

Intermediate taxa(Fagus moesiaca, Fagus taurica)

Fagus orientalis

CH, D

Jura/Schwarzwald •••

•••

UKR

Podol’e

••• •

•

CZ, SK, PL, HU

•• •

• ••

UKR, RO, SLO, HR

•• •••••

••••• •

IT

••• • •

• • •••••••

BiH, YU

Central Dinar.

••• • • •

• • •

CH

West Alps

•••••• • •

• •

MOLD

Moldova

•••••• • •

• • •

IT

Calabria

••• •••• ••••••••••••••••••

•• • • •

BG, YU

Stara Planina

• •• • • •

•••••• • •

BG, GR

Rodopy

• • • •

• • •

FYROM, GR, BG South Dinar.

•••• • •••••••••

• • •

UKR

Crimea

••••••••••••••• • •

• •

BG, TR

Thrakia

••• • •

••••••••• • ••••••••••••••••••••

TR

West Asia Mi

••• •••••••••••••••••••••• • •

• • •

TR

East Asia Mi

••••••••••• • •

• ••

Russia

West Grand Cauc ••••••••••••••••• • •

•••••••••••••••••••••••• •

Azerbaidzhan

East Grand Cauc

••••••••••••••••• •

•

Armenia

Small Caucasus

•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

Iran

Alborz

••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

UPGMA dendrogram based on genetic distances between regional

populations

Odchýlka od HW rovnováhy

Index fixácie
F = 1 – H

O/HE