NUKLEOTID

Základná stavebná jednotka DNA

DNA – polymér zložený z opakujúcich sa jednotiek

Nukleotid:

1. Dusíková báza – purín (adenín a guanín)
– pyrimidín(cytozín a tymín – v DNA,
uracil (namiesto tymínu – v RNA)

2. Cukor - (päťuhlíkový cukor)
v DNA - 2 deoxyribóza
v RNA - ribóza

3. Fosfátový zvyšok - H

3PO4

V DNA sú : A, T, G a C
V RNA sú : A, U, G a C

Dusíková báza

v DNA - 2 deoxy D ribóza

Cukor

v RNA – D ribóza

KOMPLEMENTARITA
BÁZ

KOMPLEMENTARITA
BÁZ

Reťazce DNA sú antiparalelné

Polarita

voľné
5’-PO

4

2-

3’-OH konce

Antiparalelizmus

DNA

5´-koniec 3´-koniec

3´-koniec 5´-koniec

::::::

::::::

::::::

::::::

::::::

::::::

=deoxyribóza

=fosfodieste-
rová väzba

malý

žliabok

veľký
žliabok

5´

3´

Kódujúce vlákno (sense strand)

3´

5´

Komplementárne vlákno (template strand)

D N A

Dvojzávitnica DNA

Pravo a ľavo - točivá DNA

Z

B

Rôzne formy DNA

Forma

Forma
závitnice

Po

čet
bázových
párov na
otá

čku

Vzdialenos

ť
medzi
bázovými
pármi

Vzdialenos

ť
v helixe

A

pravoto

č ivá

11

2,6

23

B

pravoto

č ivá

10

3,4

19

C

pravoto

č ivá

9,3

3,3

19

Z

ľ avot oč ivá

12

3,7

18

Úlohy DNA

Schopnosť zachovať genetickú informáciu

Odovzdať genetickú informáciu potomstvu (dcérske bunky)

Vytvárať kópie – replikácia

Schopnosť mutovať – evolúcia

Realizuje sa genetická informácia - proteosyntéza

REPLIKÁCIA DNA

Zdvojenie DNA

Prenos genetickej informácie z rodičovských
organizmov na potomstvo

Vzhľadom na dĺžku DNA v bunke trvá niekoľko hodín
( živočíšna DNA sa zreplikuje asi za 8 hod s 2 chybami)

Uskutočňuje na približne 400 miestach v jadre naraz

materské reťazce

dcérske reťazce

Semikonzervatívna = semidiskontinuálna

ku každému z pôvodných vlákien DNA sa nasyntetizuje nové vlákno

Tvorba nového reťazca podľa pravidiel komplementarity

C-G A-T

Fázy replikácie

Iniciácia - začatie

Elongácia - predlžovanie

Terminácia - ukončenie

Topoizomeráza

helikázy – rozpletenie reťazcov

ssb proteíny – udržujú DNA v jednovláknovom stave

3'

3'

5'

dsDNA-binding proteins

dsDNA-

ssDNA-
binding

protein(s)

ssDNA
binding

protein

Iniciácia, začína v bode ORI

dna A, B, C proteíny

U človeka je asi 100 000 miest

Replikačná vidlica

Smer pohybu v replikačnej bubline

DNA polymeráza

• hlavný enzým zodpovedný za predlžovanie reťazca DNA

• chybovosť 1 / 107

Polymeráza má aj exonukleázovú aktivitu

Katalytické jadro polymerázy α + ε + θ
β svorka- posúva sa za katalytickým jadrom a drží pohromade
materský a dcérsky reťazec (sama sa nenapojí)
γ komplex - nakladá β svorky na DNA v mieste, kde sú RNA primery

DIMÉR

vedúce vlákno

oneskorené (zaostávajúce)vlákno

Orientácia DNA reťazcov

Primozóm = dna A,B,C proteíny + RNA primáza (tvorí primer)
komplex 6 proteínov potrebných pre syntézu primeru
(3-6 nukleotidov) na 5´konci DNA vlákna

Primáza - robí chyby, nemá exonukleázovú aktivitu (nevadí)

DNA ligáza – spájanie reťazcov

Iniciácia

• RNA primer

Elongácia

• DNA Polymeráza III

Iniciácia a funkčné elementy potrebné pre začatie

replikácie eukaryotickej DNA

ORC - origin recognition complex

ORC

ORC

Doreplikovanie medzery = dokončenie syntézy dcérskych reťazcov

Prebieha v telomérach, za pomoci TELOMERÁZY

GÉN

Gén predstavuje kompletnú sekvenciu nukleovej kyseliny
(DNA alebo RNA), ktorá nesie informáciu pre syntézu určitého
produktu (funkčnej RNA alebo proteínu).

1. Gén pre funkčnú RNA – DNA úseky - kódujú primárnu
štruktúru rRNA a tRNA

2. Gén ako regulačná oblasť – úsek DNA alebo RNA (u RNA vírusov)
– plní regulačnú funkciu.
– rozpoznávaný špecif. proteínom
– napojenie signalizuje zahájenie
alebo zastavenie transkripcie
– gén nemá produkt

3. Štruktúrny gén - úsek DNA – obsahuje informáciu o
primárnej štruktúre proteínu

základná funkčná genetická jednotka

transkripcia translácia

DNA

⇨ RNA ⇨ protein

Centrálna dogma molekulovej biológie

Watson a Crick 1959

Temin a Baltimore 1973

Reverzná transkriptáza

Pozmenenie centrálnej dogmy molekulovej biológie

TRANSKRIPCIA

Prepis genetickej informácie z DNA do mRNA

Prebieha v jadre

Prokaryoty majú len jeden druh RNA-polymerázy, ktorá
katalyzuje syntézu RNA zo všetkých génov.

Eukaryoty naopak používajú viacero typov RNA-polymeráz,
ktoré zabezpečujú transkripciu z rôznych génových skupín.

Promótor rozpozná σ-faktor
proteínová podjednotka RNA-polymerázy

polymeráza začne odvíjať DNA - TATA box

Iniciácia

Transkripcia začína štartovacím kodónom ATG
označuje sa +1. Pozícia na sekvencii DNA, ktorý sa nachádza
pred týmto nukleotidom, má záporné číslovanie, 0 neexistuje

Vytvára sa dočasný hybrid DNA - RNA

RNA sa oddeľuje od DNA

Elongácia

terminácia

rho závislá

rho nezávislá

Iniciácia transkripcie eukaryotických génov

RNA polymeráza II potrebuje transkripčné faktory
(evolučne konzervované), aby dokázala nasadnúť na promótor

Iniciácia transkripcie

1. Vytvorenie čiapočky (cap)

pred 5' UTR oblasť pripojí 5'-5' väzbou guanozín

•

chráni molekulu z tejto strany

•

uľahčuje jej naviazanie na ribozóm.

Posttranskripčná úprava

hnRNA

⇨mRNA

2. Vyštiepenie intrónov (splicing)

Enzymaticky sa vystrihnú kópie intrónov a ligázou sa pospájajú exóny.

Splicing eukaryotického génu

Malé RNA človeka

Druh malej RNA výskyt funkcia syntetizujúci enzým
U1 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II
U2 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II
U4 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II
U5 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II
U6 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza III
U7 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II
histónovej hnRNA
U11 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II
U12 snRNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II
7SK snRNA jadro neznáma RNA polymeráza III
8-2 snRNA jadro úprava pre-tRNA RNA polymeráza III
U3 snoRNA jadierko úprava pre-tRNA RNA polymeráza II
U8 snoRNA jadierko úprava pre-rRNA RNA polymeráza II
U13 snoRNA jadierko neznáma RNA polymeráza II
7SI scRNA cytoplazma translokácia proteínov RNA polymeráza III

3. Tvorba chvostíka ( 3' koniec)
poly(A)polymeráza za 3' UTR nasyntetizuje
250 adenínov

medzi každý 10 adenín sa včlení bielkovina

mRNA pre históny nemá polyA chvost

Funkcia:
stabilizácia
ochrana 3´ pred účinkom degradačných enzýmov

TRANSLÁCIA

Preklad genetickej informácie z mRNA do poradia AK

Prebieha v cytoplazme na ribozómoch

16 S rRNA

rRNA sa syntetizuje v jadierku - RNA polymeráza I.

NOR – oblasť organizácie jadierka

Gény pre rRNA – akrocentr. chromoz. D a G v oblasti satelitov

Prekurzorová rRNA 45 S
+ metylácia + bielkoviny = stabilita

45 S

⇨ 28S , 18 S a 5,8 S rRNA

Prechádzajú cez jadrové póry (20nm) 5,8 S 5 min
28 S 30 min

Small RNA genes

Small

5S rRNA - RNA polymeráza III.

akceptorové rameno (bez slučky) - na jeho koniec sa viaže aminokyselina
antikodónové rameno s antikodónovou slučkou - týmto koncom tRNA rozoznáva
genetický kód zapísaný v mRNA
pseudouridínové rameno s TΨC-slučkou - obsahuje modifikovaný uracil - pseudouracil
dihydrouridínové rameno s D-slučkou- obsahuje modifikovaný uracil - dihydrouracil
variabilná slučka - môže byť krátka alebo dlhá neovplyvňuje biologickú funkciu tRNA

RNA-polymeráza I jadierko transkribuje gény pre rRNA

RNA-polymeráza II jadro transkribuje štruktúrne gény a

gény pre niektoré malé RNA

RNA-polymeráza III jadro transkribuje gény pre tRNA,
5S-rRNA a niektoré malé RNA

typ polymerázy výskyt funkcia

Fázy translácie

Aktivácia aminokyselín – AK+tRNA

Iniciácia

Elongácia

Terminácia

prediniciačný komplex

iniciačný komplex

Met tRNA

translačný komplex

ternárny komplex

Miesta na ribozóme

A – aminokyselinové AK + tRNA
P – peptidové peptidyltransferáza

E - odchod bielkovín
R - odchod tRNA

Terminácia

Prok. termináciu riadia
terminačné faktory
RF1 až RF3.

U eukar je uvoľňovací
faktor eRF
rozpozná jeden zo
STOP kodónov a
uvoľní polypeptidový
reťazec

Prokaryotická

Eukaryotická

proteosyntéza

Jadrová membrána
Neprítomná

Prítomná

Translácia iniciovaná
Shine-Dalgarnov box

5’ cap

Prvý kodón
fMet

Met

Gén 1

Gén 2

Gén 3

dlhá mRNA

Polycistronická

(viac génov)

Monocistronická

(jeden gén)

Gén

mRNA

RNA polymeráza
Jedna

I. – III.

Promótor
GACA box (-35)
TATA box (Pribnowov box) (-10)

GC-box (-90)
CAAT-box (-80)
TATA-box (Hognessov box) (-35)

Spôsoby získavania biologického materiálu

• biopsia

• nekropsia

• venepunkcia

• stery
• filtrácia

SKLADOVANIE BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU

• USKLADNENIE
- krátkodobé (chladničky a mrazničky)
suspenzné bakteriálne kultúry, bakt. na platni,
tkanivové kultúry, vysušená DNA

• ZÁLOHOVANIE
- zlyhanie analýzy (mrazničky – 20 oC)
tkanivá, rozpustená DNA , enzýmy

• ARCHIVÁCIA (hĺbkové mrazničky – 80 oC, paraf. bločky
tekutý dusík – 160 oC )
- súdne lekárstvo
- retrospektívna analýza
- nové diagnostické metódy

HOMOGENIZÁCIA

3. chemická
‑ detergenty
‑ enzymatické natrávenie

1. mechanická
‑ trecie misky
‑ homogenizátor
‑ pretlačenie cez otvor

2. fyzikálna

‑ ultrasonikácia

‑ zmrazovanie a rozmrazovanie

‑ hypotonizácia

Restrikčné enzýmy

Restrikčné endonukleázy, restriktázy

Rozpoznávajú PALINDRÓM

GAATTC
CTTAAG

štiepia špecificky 2 vláknovú DNA

5’

 3’

3’

5’

Štiepenie DNA restrikčnými enzýmami

TUPÉ KONCE

LEPIVÉ KONCE

Gélová elektroforéza

Rýchlosť pohybu molekúl závisí od:

• Rozmerov molekúl DNA

Zmes DNA molekúl
rozličných veľkostí

Zdroj

prúdu

Gél

Sklené platne

Dlhšie
molekuly

Kratšie
molekuly

Gél po ukončení elektroforézy

Rýchlosť pohybu molekúl závisí od:

• Koncentrácie gélu
• Konformácie DNA
• Veľkosti elektrického napätia
• Zloženia roztokov
• Teploty

Elektroforetická kontrola
dobre vyizolovanej DNA

• po dokončení elfo sa veľkosti fragmentov DNA

stanovujú pomocou fragmentov známej dĺžky -
veľkostných štandardov

METÓDY MOLEKULOVEJ BIOLÓGIE

A ICH VYUŽITIE

PCR
VNTR
Sekvenovanie
RFLP
Fingerprint
FISH

Teplotný cyklovač

1. templátová DNA

2. PCR primery

3. dNTP

4. Taq polymeráza (150 nukl./s)

5. reakčný roztok

Reakčná zmes

Na uskutočnenie PCR je treba mať:

PCR skúmavky

Polymerázová reťazová reakcia

1.

Denaturácia teplom ( 94-96şC)

2.

Naviazanie primerov (50-65şC)

3.

Syntéza DNA ( 70-72şC)

4.

Postup sa opakuje

po 30 cykloch vzniká viac ako
milión kópií

C

Y

K

L

U

S

VNTR - (variabilný počet tandemových opakovaní)

pomocou PCR

ATTGGA- motív

14 9 4

dĺžka úseku DNA „alela“ príslušného VNTR systému

Alely sa prenášajú z rodičov na deti (1 alela od otca a 1 od matky)

Používa sa od 90 tych rokov vo foréznej medicíne.

Metóda využíva variabilitu pri opakovaní krátkých sekvencií
nukleotidov v určitých úsekoch DNA.

STR - Short Tandem Repeat

Aby bola dosiahnutá vysoká rozlišovacia schopnosť, je
vyšetrovaných viacej STR polymorfizmov zároveň.

A T G C

T
C
G
A
A
G
T
C
G
T
T
G
A
C
G
G
T
T
A
C
G

C

A

T
A
C
C
T
G

A

A
A
C
C

C

C

G

T

A

A

Sekvenovanie DNA

1. Sangerova metóda (r. 1975)

2. Maxamova-Gilbertova metóda (r. 1977)

3. Automatické sekvenátory (r. 1995)

- určenie presného poradia nukleotidov v DNA

Sangerova metóda sekvenovania

Princípom - klasická PCR

Ale!
- pri syntéze dôjde k náhodnému zastaveniu
dideoxyribonukleozidtrifosfáty – ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP

- nemôže naviazať ďalší deoxyribonukleotid
- vznikajú tak nedokončené úseky s rôznou dĺžkou
- oddelenie pomocou elektroforézy

Fluorescenčná in situ hybridizácia

Typy sond pre FISH: 1. Centromerické

2. Génové (lokusovo špecifické)

3. Celochromozómové („paintingové“)

typy polymorfizmu DNA
- majú odlišný molekulový základ

bodový polymorfizmus
(RFLP, Sekvenovanie)

hypervariabilné oblasti DNA
(RFLP, Fingerprint, VNTR, STR)

Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism

1. izolácia DNA

2. štiepenie DNA jedným restrikčným enzýmom

3. Rozdelenie DNA fragmentov v elektroforéze

Fragmenty v géli sú stále dvojvláknové

4. Denaturácia DNA fragmentov

Chemická denaturácia - pH 12

5. Neutralizácia

Fragmenty zostanú jednovláknové

6. Southernov blotting

Prenos fragmentov DNA z gélu na membránu
(nylonová, nitrocelulózová)
– kapilárna elevácia

6. Southernov blotting

8. Príprava sondy

7. Fixácia DNA v membráne

Vákuová sušička 2 hod. pri 80 oC

Jednovláknový úsek DNA - rádioaktívne značená

9. Hybridizácia

DNA zo spermií lososa

10. Autorádiografia a vyvolanie RTG filmu

11. Vyhodnotenie výsledkov

Kosáčiková anémia

S : CCT GTG GAG
Pro Val Glu

146 AK v β-globínovom reťazci
hemoglobínu

substitučná mutácia – zámena
adenínu za tymín v 6. AK:

A : CCT GAG GAG

Pro Glu Glu

Kosáčiková anémia metódou RFLP

exón

exón

intrón

Gén pre beta-globín

175 bp

201 bp

A S

175

201

376

A S

Prof. Alec Jeffreys - 1984

Fingerprint

Prípad 1

Prípad 2

1 2 3 5 6 7 8 9

1 2 3 4

Možnosti využitia

• Diagnostika genetických (monogénnych aj

multifaktoriálnych) a nádorových ochorení

• Génová terapia (genetických a nádorových

ochorení)

• Cielená liečba („molekulárna farmakológia“)

• Štúdium biologických funkcií na molekulárnej

úrovni (diferenciácia, starnutie ...)

• Evolúcia človeka a pôvod ľudských populácií

Podstatný krok - poznanie biológie nášho druhu!