PYROSEQUENCING

J.L.

Pyrosekvenovanie

-je bioluminometrická jednoskúmavková sekvenovanovacia metóda,

ktorej výhodou je kooperácia medzi 4 enzýmami pre monitorovanie syntézy dna.

-V tomto sekvenovaní, ktoré prebieha počas syntézy dna kaskáda enzymatických reakcií vyprodukuje

detegovateľné svetlo, ktoré je úmerné zabudovaným nukleotidom.

-Výhodou je presneý , flexibilný a paralelný processing

rýchle sekvenovanie krátkych DNA sekvencií (bar codes), bez gélovej elektroforézy

využitie: SNP

identifikácia haplotypov u hepatitídy typu C

detekcia bodových mutácií

Krok 1
Primer pre sekvenovanie je prihybridozovaný k jednovláknovému, PCR amplifikovanému DNA

templátu a inkubovaný s enzýmamii:

DNA polymeráza
ATP sulfuryláza
luciferáza
apyráza

substráty: adenozín-5’- fosfosulfát (APS)
luciferín

Krok 2
Prvý zo 4 dNTP (deoxyribonukleotidtrifosfát) je pridaný k reakcii
DNA polymeráza katalyzuje zabudovanie deoxyribonukleotidtrifosfátu do DNA vlákna, ak je komplementárny k báze v

templátovom vlákne.

Tento krok, keď je nukleotid zabudovaný je sprevádzaný uvoľnením pyrofosfátu (PPi) v kvantite equimolárnej k

množstvu inkorporovaného nukleotidu.



Krok 3



ATP-sulfuryláza kvantitatívne konvertuje PPi na ATP v prítomnosti adenozín-5’-

fosfosulfát. ATP riadi luciferázou sprostredkovanuú konverziu luciferínu na

oxyluciferín, čo vytvára viditeľné svetlo v množstvách, ktoré sú úmerné k množstvu

ATP. Svetlo produkované reakciou, ktorá je katalyzovaná luciferázou je detegovná

CCD kamerou (charge coupled device) a videné ako pík v pyrograme ™.



Každé svetlo signalizuje jeho úmernosť k množstu zabudovaných nukleotidov.

Krok 4

Apyráza, enzým degradujúci nukleotidy, kontinuálne degraduje

nezabudované dNTP a nadbytočný ATP.

Ked je degradácia kompletná, je pridaný ďalší dNTP.

Krok 5

Pridanie dNTP sa uskutočnuje jeden po druhom. Deoxyadenozín α-tiotrifosfát

(dATPS) je používaný ako náhrada za deoxyadenozín-trifosfát(dATP), pretože

je účinne výužívaný DNA polymerázou ale nerozpoznávaný luciferázou.

Počas tohto procesu je vytvorené komplementárne DNA vlákno a

nukleotidová sekvencia je zistená zo signálu, píku v pyrograme.

PYROGRAM

http://www.pyrosequencing.com/

Ďakujem za pozornosť!