Cloning technologies

for protein expression

and purification

Lucia Lichvárová Katedra molekulárnej

biológie

 Introduction
 Klonovacie vektory
 Cloning for protein expression and

purification

 Cloning sites and technologies
 Conclusions and recommendations
 Zhrnutie

Detailné znalosti z biochémie
a poznanie štruktúry jednotlivých proteínov je
základom pre biochemické skúmania.

Správanie proteínov je v značnej miere
variabilné takže aj ked sekvenovanie genómov
prebieha automaticky,
proteíny musia byť purifikované v dostatočnej
kvantite a to predovšetkým z rekombinantných
zdrojov.

Klonovanie DNA pozostáva z troch
základných krokov:

1.

Príprava rekombinantnej DNA

2. Prenos rekombinantnej DNA do hostiteľskej bunky
(transformácia)

3. Selekcia klonov obsahujúcich rekombinantnú DNA

Klonovací vektor (prenášač)
- je molekula DNA, ktorá je schopná prijať
cudzorodú DNA a spolu s ňou sa autonómne
replikovať v hostiteľskej bunke.
- najčastejšie odvodené od plazmidov alebo
bakteriofágov lambda a P1 fága

Klonovacie miesto na N a C konci musí byť
kompatibilné s vektorom , musí byť zachovaný
správny čítací rámec a orientácia.

Základné vlastosti plazmidových vektorov :

1. Počiatok replikácie
- zabezpečujúci stabilné uchovávanie

rekombinantov v hostiteľských bunkách.

2. Selekčný marker
- vnáša do bunky nový fenotyp
- umožní po transformácii identifikovať a
selektovať bunky obsahujúce plazmid

3. Malá veľkosť (2-15 kBp),
- čím je vektor menší, tým je vyššia jeho klonovacia

4. Klonovacie miesto
- je rozoznávacia sekvencia pre restrikčnú
cez ktorú je možné vektor štiepiť a vkladať doň
cudzorodú DNA pomocou DNA ligázy

kapacita.

endonukleázu

Konštrukcia plazmidov pri nadexpresii

proteínov pri purifikácii je často zdĺhavá,
preto sú potrebné alternatívne metódy,
ktoré sú rýchlejšie, jednoduchšie
flexibilnejšie.

úloha vektorov je zvýšiť produkciu v

danej hostiteľskej bunke

a napomôcť purifikácii.

Proteínová nadexpresia vyžaduje
3 komponenty
► gén
► vektor obsahujúci gén
► expresia v hostiteľskej
bunke, ktorá maximalizuje
význam a kvalitu proteínu
produkovaného kombináciou
vektor - gén

1. Rekombinantný proteín bol

produkovaný jednoduchým
klonovaním DNA segmentov v
multikópiových plazmidoch, čím
zvýšil počet kópií kombináciou
promótora a génu.

Neskôr objavili vplyv natívnych

proteínov a vložili ich do pozície
downstream na zvýšenie sily
promotorov.

Dnes vdaka PCR sa gény modifikujú

bežne a dalšie oblasti môžu byť
modifikované bez ohľadu na
obtiažnosť alebo expresiu.

Translácia môže byť modulovaná,
STOP kodón premiestnený,
afinita a signálne peptidy pre syntézu

génov, ktoré boli modifikované
pomocou PCR, pridaním vhodného
klonovacieho miesta

V eukaryotických bunkách sa

nachádzajú intróny, preto
klonovanie takýchto génov pre
proteínovú expresiu zvyčajne
začína vytvorením cDNA .

Využitím cDNA a PCR templátu sú

gény amplifikované, klonované,
sekvenované a následne vložené
do jedného alebo viacerých
vektorov.

Počiatočné klonovanie do neexprimovateľných

vektorov :

1.

Neúmyselná expresia génu môže zapríčiniť

toxicitu a vytvoriť rozličné klonovanie génov

priamo v expresii vektoru.

2.

Mnohé exprimované vektory sú veľké, čo

zťažuje klonovanie

3.

Pri vysokokópiových plazmidoch môže

nastať komplikácia pri klonovaní aj

sekvenovaní

4.

Chybu pri sekvenovaní môže spôsobiť

single-nucleotid polymorfizmus

5.

Chyby pri PCR primeroch vysoká fidelita

chemickej syntézy

Klonovacie miesta a technológie

Sú potrebné krátke sekvencie ktoré

sa vložia do génu a ovplyvnia tak

transláciu alebo zašifrujú domény,

ktoré majú za následok zlepšenie

purifikácie proteínu.

Element

Lokalizácia čítacieho

rámca

Funkcia

Kozak

Od -1 do -6 ATG

Zvyšuje rozpoznanie 1. ATG

riobozómu

Shine Galgarno

5 až 13 bp upstream

Zvyšuje rozpoznanie ATG v E. coli

Epitop

C koniec pri eukaryotoch Detekcia antibodies w. b.

Affinity tags

N koniec u E.coli

Proteínová purifikácia

Proteázové

miesto

Upstream

Odstránenie afinity site

Solubility tags

N koniec

Zlepšenie solubility a translácie

Internal

ribosome entry

site

Downstream od 1. génu

Expresia sekundárnych génov

Doplnková porteínová expresia zložiek z vektorov v
kazetách do ktorých boli zavedené

Typické kombinácie elementov v
proteínovej expresii v exprimovaných
vektoroch

Mnohé plazmidy boli skonštruované pomocou restrikčných

enzýmov a ligáz

Po požadovanej proteínovej konfigurácii dojde k spojeniu génu s

navrhnutým vektorom

Výber expresného vektoru

REaL (restriction enzymes and ligase)

finačne nákladná ale v raboratóriu veľmi používaná
na klonovanie génov pre proteínovú expresiu
dostupných viac ako 1000 vektorov
Flexi vector (Promega) and LIC (Novagen)
zavislé na PCR produktoch a vektory
SSR používaná pre väčšie gény a vektory
spoľahlivá metóda na zavedenie rovnakého vektoru pri multiple

expression

Gateway enzýmy sú drahé, v reakcii 5 alebo 10 mikrolitrov

v reakciách boli modifikované z buniek E.coli
Creator enzyme schopný purifikácie samého seba

Zhrnutie:
Konštrukcia plazmidov pri nadexpresii
proteínov pri purifikácii je často zdĺhavá, preto
sú potrebné alternatívne metódy, ktoré sú
rýchlejšie, jednoduchšie flexibilnejšie.

Úloha vektorov je zvýšiť produkciu v danej
hostiteľskej bunke a napomôcť purifikácii.
Klonovanie sa deje vdaka PCR

Miesto špecifická rekombinácia má omnoho
širšie použitie alternatívne k REaL pre
proteínovú expresiu

SSR miesta sú dlhšie ako restrikčné miesta a
špecifickejšie.

 Ďakujem za pozornosť !