Biotechnológie

Biotechnoló

Ján Turňa

Ján T

turna@fns.uniba.sk

@fns.unib

Katedra molekulárnej biológie

Katedr

dmb.fns.uniba.sk

dmb.fns.unib

Prírodovedecká fakulta

Prírodo

Univerzita Komenského

Bratislava

Br



V súčasnosti sa termín GMO pre väčšinu

V súčasnosti sa termín GMO pre väčš

verejnosti spája automaticky s geneticky

verejnosti spája automaticky s geneticky

modifikovanými rastlinami. História

modifikovanými rastlinami. Hist

používania GMO sa viaže práve na

používania GMO sa viaže práve

mikroorganizmy.

mikroorganizm



V tomto roku je to presne 30 rokov, čo

V tomto roku je to presne 30 rokov,

Stanley Cohen pripravil prvú rekombinantnú

Stanley Cohen pripravil prvú rekombinant

DNA a tým zahájil éru génového inžinierstva.

DNA a tým zahájil éru génového inžinierst



S.N. Cohen et al., "Construction of biologically

S.N. Cohen et al., "Construction of biologicall

functional bacterial plasmids in-vitro," Proceedings

functional bacterial plasmids in-vitro," Proceedings

of the National Academy of Sciences, 70:3240 4, 1973

of the National Academy of Sciences, 70:3240 4, 1



História diskusie o riziku technológie

rekombinantných DNA je poučná do

rekom

dnešných dní. Bola to práve vedecká

dnešných dní. Bola to práve vedecká

komunita, ktorá si ako prvá uvedomila

komunita, ktorá si ako prvá uv

potenciálne riziko tejto silnej technológie.

potenciálne

Konkrétne to bol Paul Berg, ktorý vyzval

Konkrétne to bol Paul Berg, ktorý

k medzinárodnému moratóriu na výskum

k medzinárodnému moratóriu na

rekombinantných DNA.

rekom



P. Berg et al., "Potential biohazards of recombinant

P. Berg et al., "Potential biohazards of recomb

DNA molecules," Science, 185:303, 1974

DNA molecules," Science, 185:303, 19



P. Berg mal isté pochybnosti aj preto, že pracoval

P. Berg mal isté pochybnosti aj preto, že pracova

s SV40 – ten má tumorigénny charakter

s SV40 – ten má tumorigénny charakte



Jún 1973 - Gordon Conference diskutovali sa

Jún 1973 - Gordon Conference

otázky bezpečnosti a požiadali NIH aby

otázky bezpečnosti a požia

vymenoval komisiu.

vymenoval kom



Recombinant DNA advisory committe – RAC

Recombinant DNA advisory com



február 1975 - Asilomarsk

Asilom

á konferencia za účasti

právnikov a žurnalistov.

právnikov a žurna



RAC bol rozšírený z 12 na 16 členov a prvé

RAC bol rozšírený z 12 na 16

The

Guidelines for Research Involving Recombinant

Guidelines for Research Involving Recombina

DNA Molecules boli publikované 23.júna 1976.

Platili len pre federálne financovaný výskum

Platili len pre federálne financova



Zníženie rizika:



Znížiť schopnosť prežitia hostiteľa

v prostredí (auxotrofné mutácie)



Znížiť schopnosť replikácie a realizácie

Znížiť schopnosť rep

genetickej informácie z vektora (amber

amb

mutácie, supresorové kmene)



Znížiť schopnosť horizontálneho

prenosu génov (traD36)

Predaj biotechnologických

Predaj biotechnologickýc

produktov vyrobených

produktov vyrobených

fermentač

ferm

ne

s využitím rDNA

s využitím rD



Najrýchlejšie rastúci trh



Objem >40 miliard USD



Humulin

Hum

Eli Lilly

Eli Li

október 1982



Protropin

Genentech

Ge

oktober

1985



Roferon alpha2a

Hoffman-La Roche

Hoffman-L

jún 1986



Intron alpha2b Shering-Plough

Shering-Pl

jún 1986



Recombivax HB

Recombiva

Merck

júl 1986



Humatrope

Hum

Eli Lilly

Eli Li

marec 1987

ma



Epogen

Amgen

Am

jún 1989



Energix-B

SmithKline

SmithKli

sept. 1989



Posudzovanie biologického rizika

použitia geneticky modifikovaných

použitia geneticky modifi

mikroorganizmov



Pri hodnotení možného rizika práce

s GMMaS sú hlavným kritériom možné

s GMMaS sú hla

negatívne účinky na zdravie človeka

a životné prostredie



Posudzovanie rizika GMM vyžaduje

poznať negatívne účinky a to tak

modifikovaného génu alebo sekvencie,

modifi

ako aj príjemcu a donora



Hostiteľ

Host



Dôraz pri zvažovaní rizika je kladený predovšetkým

Dôraz pri zvažovaní rizika je kladený predovše

na patogenicitu hostiteľského organizmu, vrátane

na patogenicitu hostiteľského organizmu, vrát

jeho virulencie, infektivity a toxicity. Ak je náležitá,

jeho virulencie, infektivity a toxicity. Ak je nále

posudzuje sa tiež alergénnosť, pri tkanivových

posudzuje sa tiež alergénnosť, pri

kultúrach tiež prítomnosť vedľajších škodlivých

kultúrach tiež prítomnosť vedľajších škodl

činiteľov.

čini



Pri posudzovaní patogenicity, je dôležité zvážiť možné

Pri posudzovaní patogenicity, je dôležité zváži

následky po expozícii. Ak je hostiteľský organizmus

následky po expozícii. Ak je hostiteľský organizmus

známy ako ľudský patogén, automaticky vyžaduje

známy ako ľudský patogén, automaticky vyžaduj

zaradenie do vyššej rizikovej skupiny. Ak je však

zaradenie do vyššej rizikovej skupiny. Ak je

recipient atenuovaný a je známe, že nie je virulentný

recipient atenuovaný a je známe, že nie je virule

(E. coli

E. c K12), môže byť považovaný za malé riziko, so

K12), môže byť považovaný za malé

zatriedením v najnižšej rizikovej skupine vo väčšine

zatriedením v najnižšej rizikovej skupine vo väčši

prípadov.



Vnášané gény a sekvencie

Vnášané gény a sekve



Toto sa týka najmä prípadov, keď produkt vnášaného

Toto sa týka najmä prípadov, keď produkt vnášané

génu má biologické vlastnosti, ktoré môžu byť

génu má biologické vlastnosti, ktoré môžu by

škodlivé, napr. toxíny, cytokíny, alergény, hormóny

škodlivé, napr. toxíny, cytokíny, alergény, hor

atď. Posudzovanie musí obsahovať odhad úrovne

atď. Posudzovanie musí obsahovať odhad úrovne

expresie génu.

expres



V prípadoch, keď sa vnášaný gén neexprimuje, alebo

V prípadoch, keď sa vnášaný gén neexprimuje, ale

jeho produkt je v neaktívnej forme, ako sú inklúzne

jeho produkt je v neaktívnej forme, ako sú inklúzne

telieska, je málo pravdepodobný jeho škodlivý efekt.

telieska, je málo pravdepodobný jeho škodlivý e

Toto je prípad expresie mnohých ľudských génov v

Toto je prípad expresie mnohých ľ

E.

coli alebo iných prokaryotických systémoch, nie však

alebo iných prokaryotických systémoch, nie

všetkých. Napr. veľa neglykozylovaných cytokínov je

všetkých. Napr. veľa neglykozylovaných cytokínov j

rozpustných a biologicky aktívnych pri expresii v

rozpustných a biologicky aktívnych pri expre

E.

coli.



Modifikácia existujúcich determinantov patogenicity

Modifikácia existujúcich determinantov patogenici



Modifikácie génov, ktorých produkty majú škodlivé

Modifikácie génov, ktorých produkty majú škodl

účinky nie sú príliš časté, avšak je možná modifikácia

účinky nie sú príliš časté, avšak je možná mod

už existujúcich determinantov patogenicity, vnesením

už existujúcich determinantov patogenicity, vnesením

iného génu, či zosilnením jeho expresie. V takomto

iného génu, či zosilnením jeho expres

prípade je potrebné zvažovať jednak virulenciu

prípade je potrebné zvažovať jednak virulenci

a patogenicitu hostiteľa, ako aj možnú virulenciu,

a patogenicitu hostiteľa, ako aj možnú vir

patogenicitu a úroveň expresie vnášaného génu.

patogenicitu a úroveň expresie vnášaného gé

Medzi determinanty patogenicity patria napríklad:

Medzi determinanty patogenicity patria napr

bakteriálne toxíny, invazíny, integríny, povrchové

bakteriálne toxíny, invazíny, integríny, povrchové

štruktúry ako pili, LPS a kapsidy. Dôležitý je tiež vzťah

štruktúry ako pili, LPS a kapsidy. Dôležitý je

možnej terapie pri náhodnej infekcii.

možnej terapie pri náhodnej infe



Posúdenie následkov možného

Posúdenie následkov možné

horizontálneho prenosu

horizontálneho preno



V tejto časti je posudzované riziko spojené

V tejto časti je posudzované riziko spoje

s prípadným uvoľnením GMM do prostredia

s prípadným uvoľnením GMM do prostredi

a jeho možný vplyv na príbuzné

a jeho možný vplyv na príbuzné

mikroorganizmy. Toto sa týka čiastočne

mikroorganizmy. Toto sa týka čiastoč

niektorých markerov, nesúcich gény pre

niektorých markerov, nesúcich gény p

rezistencie na klinicky významné antibiotiká

rezistencie na klinicky významné antibioti

alebo intaktné provírusy. Tu hrá významnú

alebo intaktné provírusy. Tu hrá význam

úlohu životnosť hostiteľa, prítomnosť znaku

úlohu životnosť hostiteľa, prítomnosť zna

na chromozóme alebo mobilných

na chromozóme alebo mobilný

elementoch, vplyv selekčného tlaku

elementoch, vplyv selekčného t

prostredia expresie/prežitia znaku, ako aj

prostredia expresie/prežitia znaku, ako

samotná prítomnosť génu v prostredí

samotná prítomnosť génu v prostr

a zároveň odhad pravdepodobnosti.

a zároveň odhad pravdepodobno



BAKTÉRIE

BAKTÉRI



Druh

Klasifik

Klasifi ácia



Acinetobacter calcoaceticus

Acinetobacter calcoace

2



Acinetobacter lwoffi

Acinetobacter l

2



Actinobacillus actinomycetemcomitans

Actinobacillus actinomycetemcomi

2



Actinomadura madurae

Actinomadura madu

2



Bacillus anthracis

Bacillus anthr

3



Bacteroides fragilis

Bacteroides frag

2



Bartonella bacilliformis

Bartonella bacillifor

2



Bordetella bronchiseptica

Bordetella bronchisept

2



Bordetella parapertussis

Bordetella parapertussi

2



Borrelia spp.

Borre

2



Brucella abortus

Brucella abo

3



Brucella canis

Brucella ca

3



Brucella melitensis

Brucella melite

3



Brucella suis

Brucella sui

3



Burkholderia cepacia

Burkholderia cepa

2



Burkholderia cepacia

Burkholderia cepa

2



Burkholderia spp

Burkholde

2



Campylobacter fetus

Campylobacter fe

2



Campylobacter jejuni

Campylobacter j

2



Campylobacter spp.

Campylobact

2



Clostridium botulinum

Clostridium botul

2



Clostridium perfingens

Clostridium perfinge

2



Clostridium tetani

Clostridium teta

2



Clostridium spp.

Clostridium s

2



Corynebacterium spp.

Corynebacterium

2



Coxiella burnetii

Coxiella burne

3



Edwardsiella tarda

Edwardsiella t

2



Ehrlichia sennetsu (Rickettsia sennetsu)

Ehrlichia sennetsu (Rickettsia senne

2



Ehrlichia spp.

Ehrli

2



Francisella tularensis

Francisella tulare

(Typ A)

(T

3



Francisella tularensis

Francisella tulare

(Typ B)

(T

2



BAKTÉRIE

BAKTÉRI



Druh

Klasifik

Klasifi ácia



Acinetobacter calcoaceticus

Acinetobacter calcoace

2



Legionella spp.

Legione

2



Leptospira interrogans (všetky sérovary)

Leptospira interrogans (všetky sérov

2



Listeria monocytogenes

Listeria monocytoge

2



Listeria ivanovii

Listeria ivano

2



Moraxella catarrhalis

Moraxella catarrha

2



Moraxella lacunata

Moraxella lacunat

2



Morganella morganii

Morganella morga

2



Mycobacterium africanum

Mycobacterium afr

3



Mycobacterium avium/intracellulare

Mycobacterium avium/intracellul

2



Mycobacterium bovis (okrem BCG)

Mycobacterium bovis (okrem BC

3



Mycobacterium chelonae

Mycobacterium chelo

2



Mycobacterium fortuitum

Mycobacterium for

2



Mycobacterium kansaii

Mycobacterium kansa

2



Mycobacterium leprae

Mycobacterium lepra

3



Mycobacterium malmoense

Mycobacterium malm

2



Mycobacterium marinum

Mycobacterium mari

2



Mycobacterium microti

Mycobacterium micro

3 (*)



Mycobacterium paratuberculosis

Mycobacterium paratubercul

2



Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tubercul

3



Mycobacterium ulcerans

Mycobacterium ulce

3 (*)

3



Mycobacterium xenopi

Mycobacterium xe

2



Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoni

2



Neisseria gonorrhoea

Neisseria gonorrho

2



Neisseria meningitidis

Neisseria meningit

2



Nocardia asteroides

Nocardia astero

2



Nocardia brasiliensis

Nocardia brasilie

2



Nocardia farcinica

Nocardia farci

2



Nocardia nova

Nocardia no

2



Nocardia otitidiscaviarum

Nocardia otitidisca

2



BAKTÉRIE

BAKTÉ



Druh

D

Klasifik

Klas

ácia

á



Providencia alcalifaciens

Providencia alcalifac

2



Providencia spp.

Providencia s

2



Psudomonas aeruginosa

Psudomonas aerugin

2



Psudomonas mallei

Psudomonas ma

3



Psudomonas pseudomallei

Psudomonas pseudom

3



Rhodococcus equi

Rhodococcus eq

2



Rickettsia akari

Rickettsia ak

3 (*)

3



Rickettsia canada

Rickettsia can

3



Rickettsia conorii

Rickettsia con

3 (*)

3



Rickettsia montana

Rickettsia monta

3 (*)

3



Rickettsia typhi (Rickettsia mooseri)

Rickettsia typhi (Rickettsia moo

3



Rickettsia prowazekii

Rickettsia prowaze

3



Rickettsia rickettsii

Rickettsia ricket

3



Rickettsia tsutsugamushi

Rickettsia tsutsugamu

3



Rickettsia spp.

Rickettsia s

2



Salmonella Enteritidis

Salmonella Enteriti

2



Salmonella Typhimurium

Salmonella Typhimu

2



Salmonella Paratyphi A, B, C

Salmonella Paratyphi A,

2



Salmonella Typhi

Salmonella Ty

3 (*)

3



Salmonella (ostatné sérotypy)

Salmonella (ostatné séroty

2



Serpulina spec.

Serpulina sp

2



Serratia liquefaciens

Serratia liquefac

2



Serratia marcescens

Serratia marcesc

2



Shigella boydii

Shigella bo

2



Shigella dysenteriae (Typ 1)

Shigella dysenteriae (Typ

3 (*)

3



Shigella flexneri

Shigella flexn

2



Staphylococcus aureus

Staphylococcus aur

2



Streptococcus spp.

Streptococcus s

2



Treptonema carateum

Treptonema carateu

2



Treptonema pertenue

Treptonema perten

2



Treptonema spp.

Treptonema s

2



Vibrio spp.

Vibrio s

2



Vibrio enterocolitica

Vibrio enterocol

2



Ureaplasma urealyticum

Ureaplasma urealyti

2



Yersinia pestis

Yersinia p

3



Yersinia pseudotuberculosis

Yersinia pseudotubercul

3



Yersinia spp.

Yersinia s

3

www.genefiles.org



Prakticky všetky použitia

modifikovaných mikroorganizmov sa

modifi

dotýkajú použitia v uzatvorených

dotýkajú použitia v uza

priestoroch v EU doposiaľ iné použitie

nebolo schválené

nebolo schvá



Directive 90/219/EEC on contained use

of genetically modified microorganisms

of genetically modifi

s úpravou 98/81/EC



Mikroorganizmus

Mikroorganizm je bunkový jedinec alebo nebunkový jedinec

je bunkový jedinec alebo nebunkový jedine

schopný množiť sa a odovzdávať genetický materiál, vrátane vírusov,

schopný množiť sa a odovzdávať genetický materiál, vrátane víruso

viroidov, živočíšnych buniek a buniek rastlinných kultúr.

viroidov, živočíšnych buniek a buniek rastlinných kult



Geneticky modifikovaný organizmus

Geneticky modifikovaný organizm (GMO) je organizmus, ktorého

(GMO) je organizmus, ktoré

genetický materiál bol zmenený spôsobom, ktorý sa prirodzene pri

genetický materiál bol zmenený spôsobom, ktorý sa prirodzene p

pohlavnom rozmnožovaní a prirodzenej rekombinácii nevyskytuje za

pohlavnom rozmnožovaní a prirodzenej rekombinácii nevyskytuje

GMO sa nepovažuje organizmus, kde došlo ku genetickej zmene:

GMO sa nepovažuje organizmus, kde došlo ku genetickej zm



bunkovou fúziou

bunko

prokariotických druhov mikroorganizmov, ktoré si

prokariotických druhov mikroorganizmov, ktoré

vymieňajú genetický materiál známymi fyziologickými procesmi,

vymieňajú genetický materiál známymi fyziologickými procesm

vrátane fúzie protoplastov

vrátane fúzie protoplasto



bunkovou fúziou

bunko

buniek eukaryotických druhov mikroorganizmov,

buniek eukaryotických druhov mikroorganizm

vrátane fúzie protoplastov, produkcie hybridomasy a fúzie rastlinných

vrátane fúzie protoplastov, produkcie hybridomasy a fúzie rastlinný

buniek

bunie



samoklonovaním

samoklon

, ktoré pozostáva z odstránenia sekvencií nukleovej

, ktoré pozostáva z odstránenia sekvencií nukle

kyseliny z bunky, za ktorým môže nasledovať spätné vloženie všetkej

kyseliny z bunky, za ktorým môže nasledovať spätné vloženie vše

odstránenej nukleovej kyseliny alebo jej časti, alebo jej syntetického

odstránenej nukleovej kyseliny alebo jej časti, alebo jej syntetické

ekvivalentu spolu s predchádzajúcimi enzymatickými alebo

ekvivalentu spolu s predchádzajúcimi enzymatickými ale

mechanickými krokmi do buniek fylogeneticky úzko príbuzných

mechanickými krokmi do buniek fylogeneticky úzko príbuz

druhov, ktoré si môžu vymieňať genetický materiál prirodzenými

druhov, ktoré si môžu vymieňať genetický materiál prirodzený

fyziologickými procesmi, alebo bez nich.

fyziologickými procesmi, alebo bez nic



Pri hodnotení rizík spojených s GMM

musíme predovšetkým brať do úvahy účel

musíme predovšetkým brať do úvahy úče

použitia:



Farmaceutické výroby (rekombinantné

Farmaceutické výroby (rekom

proteíny a peptidy)

proteíny a pe



Priemyselné fermentácie (aminokyseliny,

Priemyselné fermentácie (aminokyseliny

organické kyseliny, rozpúšťadlá,)

é kyseliny, rozpúšťa



Potravinárske aplikácie mikroorganizmov

Potravinárske aplikácie mikroorga



Environmentálne využite mikroorganizmov

Environmentálne využite

(bioremediácie, biometalurgia)

(bioremediácie, biometalurgia

Farmaceutické výroby



výhoda použitia baktérií vo výrobe



zvládnutá expresia



technológia purifikacie je zahrnutá už v

technológia purifikacie je za

príprave rekombinantu

príprave rekombina



stredne veľké fermentácie pre väčšinu

produktov



schválených približne 200 produktov



vo vývoji okolo 2000 produktov



otázky dĺžky schvaľovacieho procesu



inzulin schvaľovanie 2 roky

inzulin schvaľovanie 2



duševné vlastníctvo - EPO



problém obsahu DNA vo výslednom

proteíne

Priemyselné fermentácie



výroba priemyselných enzýmov –GMO?



aminokyseliny



produkcia sekundárnych metabolitov



metabolické inžinierstvo – GMO?

metabolické inžinierstvo – GM

Potravinárske aplikácie

Potravinárske aplikác

mikroorganizmov

mikroorganizmo



Použitie mikroorganizmov vo výrobe

Použitie mikroorganizmov vo výrob

potravín veľmi staré



Probiotické kultúry



Analógia s „GMO potravín“

Environmentálne využitie

Environmentálne využiti

mikroorganizmov

mikroorganizmo



riziko „nekontrolovateľného úniku“

organizmov alebo génov do prostredia

organizmov alebo génov do p



antibiotiková rezistencia – resp. iné

selekčné márkre



dilema medzi „bezpečnosťou“ a

dilema medzi „bezpečnosťou“ a

selekčnou výhodou

selekčnou výhod

Ďakujem

Vyfermentovaná pôda

Biomasa

Supernatant

S produktom Bez produktu

Bunečné fragmenty

Extrakt s produktom

Čistý produkt

Biomasa ako produkt

Separácia

tuhých častíc

Inaktivácia pre rizikovú

skupinu 2 a viac

Odpad

(BČOV)

Dezintegrácia

buniek

Sterilná filtrácia

(voliteľné)

Precipitácia

Chromatografia

a pod.

Separácia

tuhých častíc

Bez produktu S produktom

Inaktivácia

(voliteľné)