Projekt ľudského genómu

Prehistória
História
Ciele
Metódy
Priebeh
Výsledky
Využitie
Perspektívy

--------------------
základná www stránka:
www.doegenomes.org

Prehistória: Watson a Crick 1953

Genetika človeka v r. 1953

hodnotenie rodokmeňov
štúdium dvojčiat

štúdium dvo

cca 50 monogénnych ochorení

cca 50 monogénnych ocho

5 monogénnych znakov (ABO, Rh...)

5 monogénnych znakov (ABO, Rh.

48 chromozómov !

48 chromozómov

5 miliónov génov !
žiadna DNA (podľa učebníc) !

žiadna DNA (podľa učebníc)

60-te roky: cytogenetika človeka

1956: 46 chromozómov

1956: 46 chromozómo

1959: chromozómové aberácie a

1959: chromozómové aberácie

choroby

choro

1960: nomenklatúra a metodika

1960: nomenklatúra a meto

chromozómy a nádory

chromozómy a nád

chromozómy: „orgán“ lekárskej

chromozómy: „orgán“ lekársk

genetiky

genetik

ľudských génov jeden milión, o

ľudských génov jeden milión

DNA stále ani zmienka...

DNA stále ani zmienka.

70-te roky: žeby DNA?

polymorfizmy (sérové skupiny, izoenzýmy...)

polymorfizmy (sérové skupiny, izoenzým

väzba a chrom. lokalizácia

väzba a chrom. lokalizáci

bunkové hybridy

bunkové hybrid

biochemická genetika

biochemická geneti

Ale už aj:

Ale u

prvé RFLP

prvé R

v ľudskej DNA (1978)

v ľudskej DNA (197

DNA diagnostika

DNA diagnosti

chorôb (1979)

chorôb (197

100 000 génov

100 000 gén

Human Genome Project: história

1984: Alta Utah USA: vznik idei oskevenovať ľ. g.
1986: Santa Fe - DoE Intl. Meeting

–

záver: projekt je uskutočniteľný a bude znamenať

veľký pokrok v biológii

1988:

–

vznik Úradu pre výskum ľudského genómu

–

Kongres USA schválil 15 ročný projekt a dotáciu 3

mld USD

1989: založenie HUGO (The Human Genome Org.)

–

cieľ: koordinácia HGP projektov na celom svete

–

3 centrá: - Bethesda pre USA

- Londýn pre Európu
- Tokyo pre oblasť Pacifiku

1990: začiatok projektu
2005: predpokladané ukončenie

HGP: rozsah

3 200 x 106 bp (dĺžka Dunaja v mm !)
dovtedy najdlhší sekvenovaný úsek: ľudská mtDNA (16
500 bp, 1981)
vtedajšia rýchlosť: 100 bp / osoba / deň
cena: 5 - 10 USD/bp

Oficiálny začiatok HGP: 1990

20 pracovísk zo 6 štátov
3 mld USD
cca 15 rokov práce (t.j. do r. 2005)

História sekvenovania DNA

bp/osoba/rok

rok

udalosť

1

1965

Holley sekv. alanyl tRNA S. cerev.

15

1970

Wu sekvenoval 12 bp lambda fága

150

1 500

1977
1978

Sanger dideoxy, Gilbert chem. sekv.
Sanger sekv. phi-x174 (5375 bp)

15 000

1980

Messing vyvinul M13 vektor

25 000

1986

Hood – čiastočne automat. sekv.

1,000 000

1995

Venter – autom. fluoresc. sekv.

150, 000 000

1999

Perkin-Elmer 96 kapilárny sekv.

? 000, 000 000

2004

každý kto má vybavenie

HGP: ciele

Triangulovať genóm pomocou DNA markerov
Identifikovať a mapovať gény, určiť ich štruktúru a

funkciu v zdraví aj v patológii
Identifikovať dôležité mimogénové sekvencie
Určiť úplnú sekvenciu genómu (3,2 Gb)
Všetky dáta uložiť vo verejne prístupných databázach

–

1996: Bermudská dohoda

Sekvenovať genómy modelových organizmov

(drozofila, myš, C. elegans, A. thaliana a i.)

Skúmať etické, legálne a sociálne aspekty

HGP: navrhovaný postup

Konštrukcia genetickej mapy s vysokým rozlišovaním
Konštrukca rôznych typov fyzických máp všetkých

chromozómov
Vývoj vhodných laboratórnych technológií
Vývoj hardware a software na spracovanie získaných

údajov
Kompletizácia, analýza a anotácia sekvencie ľudskej

DNA

Metódy mapovania

Genetické mapy pomocou DNA polymorfizmov



slúžia ako triangulačné body pri mapovaní génov



sú nevyhnutným predpokladom klonovania génov



slúžia ako rámec na konštrukciu fyzických máp



1987 – prvá genetická mapa človeka



403 polymorfizmov väčšinou typu RFLP



1992 – genetická mapa založená na STR



významný prelom (813 markerov)



1994 – integračná mapa



5800 markerov, denzita 0,7 cM

Metódy mapovania – pokr.

Fyzické mapy



sú rôzne typy s rozdielnou rozlišovacou schopnosťou



cytogenetické mapy:



rôzne typy prúžkovania chromozómov (G-, R-

prúžk.)



rozlišovacia schopnosť niekoľko Mb



radiačné hybridné mapy:



fragmentácia chromozómov ožiarním



vytvorenie hybridných chromozómov fúziou s inými

typmi buniek (myš, potkan)



rozlišovacia schopnosť cca 0,5 Mb



kontigové mapy prekrývajúcich sa klonov



YAC klony – rozlišovanie niekoľko 100 kb



BAC klony – rozlišovanie do 300 kb



kozmidové klony – rozlišovanie cca 40 kb

Metódy mapovania – pokr.

STS mapy – Sequence Tagged Site

–

vyžadujú informáciu o sekvenčnom zložení zoradených

klonov

–

metóda detekcie: PCR

–

rozlíšenie cca 100 kb

EST mapy – Exprimed Sequence Tag

–

sú to vlastne STS mapy pre kódujúcu DNA

–

príprava: sekvenovanie cDNA a ich spätné

zmapovanie do fyzických máp

–

rozlíšenie cca 40 kb

sekvenčná mapa

–

kompletná nukleotidová sekvencia DNA

–

rozlíšenie 1 bp

HGP: hierarchická stratégia sekvenovania

(„clone-by-clone“)

triangulovať genóm pomocou

STR
zostrojiť BAC-knižnice
mapovať klony do STR mapy
utvoriť BAC kontigy
štiepiť BAC-y náhodne na

sekvenovateľné fragmenty
sekvenovať fragmenty
zoradiť do konečnej sekvencie

klonu
zoradiť sekvencie klonov do

definitívnej sekvencie
anotovať sekvenciu

HGP: Francis Collins a Eric Lander

Nárast údajov o sekvencii 1996-2001

1998 - Craig J. Venter a Celera Genomics

Stratégia sekvenovania: Celera

Genomics

Celogenómová shotgun
stratégia sekvenovania
Skombinovanie s
dátami HGP
Utvorenie knižníc s
definovanými dĺžkami
(2,10,50 kb)

HGP v Bielom Dome, jún 2001

2005

Nature

Natur 431, 931 - 945 (21 October 2004);

431, 931 - 945 (21 October 20

doi:10.1038/nature03001

doi:10.1038/nature03

Finishing the euchromatic sequence of the

human genome

INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM

INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORT

http://vega.sanger.ac.uk/Homo_sapiens/
www.ensembl.org

Dokončená sekvencia (2004):

základné údaje

pokrýva 2,85 Gb; celý genóm má 3,08 Gb
pokrýva > 99% euchromat. genómu
sekvenačné chyby zriedkavejšie ako 1 : 100 000, priemerné
pokrytie 11-násobné
len <350 medzier (väčšinou heterochrom. úseky a vysoko
repetitívne sekvencie)
20 000 – 25 000 proteíny kódujúcich génov (22 287)
priemerne 9 génov na Mb; veľká variabilita
232 000 exónov; v priemere 10,4 exónu na gén; exóny tvoria len
1,2% dĺžky sekvencie
identifikovaných cca 20 000 pseudogénov, asi ich je viac ako génov
segmentové duplikácie tvoria 5,3% euchromatickej sekvencie
(„evolutionary gene nurseries“)
ale pozor: anotácia sekvencie stále ešte nie je dokončená!

HGP: možnosti využitia

Etiológia genetických a nádorových ochorení
Diagnostika monogénnych a nádorových ochorení
Diagnostika multifaktoriálnych ochorení
Génová terapia (genetických a nádorových ochorení)
Cielená liečba („molekulárna farmakológia“)
Štúdium biologických funkcií na molekulárnej úrovni

(diferenciácia, starnutie ...)
Evolúcia človeka a pôvod ľudských populácií
Nosce te ipsum: podstatný krok k poznaniu biológie

nášho druhu
Podstatná časť práce je ešte len pred nami

Pozične
klonované
gény s
využitím HGP
sekvencie