2005

Katedra molekulárnej biológie

Andrej Ficek

Polymorfizm

Polymorfi

us ľudskej DNA

Genetický polymorfizmus

Definícia (Ford): Geneticky podmienený znak s najmenej

dvomi diskontinuitnými variantmi v jednej populácii,

pričom početnosť zriedkavejšieho variantu je vyššia ako

1%

Vylučuje: negenetické znaky, kontinuitnú variabilitu,

polytypizmy, zriedkavé znaky (dedičné choroby)

Typy polymorfizmu:

–

morofologický

–

funkčný

–

serologický

–

biochemický

–

DNA: je najčastejší, lebo väčšina polymorfizmov DNA

nemá fenotypový prejav

Typy DNA polymorfizmov

Bodový polymorfizmus - substitúcie jednotlivých báz

(SNP – single nucleotide polymorphism)

Variabilný počet tandemových repetícií

–

mikrosatelity (STR – short tandem repeat)

–

minisatelity (VNTR – variable number of tandem

repeats)

Prítomnosť/neprítomnosť sekvencie (Alu, L1 a i.) na

špecifickom mieste (indel)

Bodový polymorfizmus

(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)

.... CTCGACTTT......

.... CTCGTCTTT......

Početnosť: 1 : 1000 bp; v genóme cca 3 mil.,
Výskyt: intróny, nekódujúce oblasti (väčšinou žiadny fenotyp); len asi 50

000 v kódujúcich sekvenciách génov
Vznik: mutácia + genetický drift; nepoznáme pôvodný stav, len nepriamo

(zo sekvencie u primátov);
Mutačná rýchlosť nízka: µ = 10-7 až 10-9 (najčastejšie v dinukl. CpG)
Ak zámena spôsobí vznik/zánik restrikčného miesta, je možná analýza

tohto polymorfizmu metódou RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism)

......GGTATC..... ......GGTACC.....
- vznik cieľového miesta pre restr. endonukleázu KpnI

Detekcia SNP polymorfizmu

RFLP (restriction fragment lenght polymorphism)

- restrikčné štiepenie genomickej DNA s následným Southern blottingom (dni)
- PCR amplifikácia s následným restrikčným štiepením (deň)

DNA chip analýza až 100 tisíc SNP v jednej analýze

sonda

Polymorfizmus variabilného počtu

tandemových opakovaní

....(TGAC)(TGAC)(TGAC).......
....(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC)(TGAC).........

Detekcia PCR amplifikáciou konkrétneho polymorfizmu a separáciou v géli

Polymorfizmus variabilného počtu

tandemových repetícií

Minisatelity (VNTR)

Dĺžka základnej repetície >6bp
Počet opakovaní repetície 10 – 100 (1000)
Výskyt preferenčne v telomérických oblastiach

(najmä bohaté na GC páry)
Odhadovaný počet: cca 104
Jednoduchá detekcia: Southern, PCR
Vznik nových alel: nehomologický crossover
Mutačná frekvencia: vysoká, až 10-3
Využitie: obmedzené; individuálna

identifikácia
Biologický význam: neznámy, asi selfish DNA
Špec. prípad: minisatelit (TTAGGG)n - teloméry

Mikrosatelity (STR)

Dĺžka základnej repetície 2-6bp
Počet opakovaní repetície 1 – 100
Výskyt rovnomerne po genóme
Odhadovaný počet rádovo 105
Jednoduchá detekcia: PCR
Vznik nových alel: replikačné chyby
Mutačná frekvencia: cca 10-3
Využitie: rozsiahle; individuálna

identifikácia, nepriama DNA

diagnostika, identifikácia génov
Biologický význam: neznámy, asi

selfish DNA
Výnimka: expanzie trinukleotidov u

niektorých ochorení
Najčastejší: „CA-repeat“ (asi 50 000 x

v genóme)

Inzerčno-delečný polymorfizmus

(indel)

Indel od 1 bp po niekoľko Mb

inzercie Alu, L1 – retrotranspozícia

Veľmi zriedkavý jav: unikátne udalosti

Poznáme pôvodný stav (bez inzercie)

Inzercie (Alu, L1) aj do kódujúcich sekvencií patológia

→

Praktické využitie DNA polymorfizmov

identifikácia osôb a určovanie paternity,

identifikácia neznámych génov zodpovedných

za genetické ochorenia,

nepriama dg. monogénnych ochorení,

evolučné štúdie (polymorfizmy mtDNA a Y-

chrom. DNA

Individuálna identifikácia

„DNA fingerprint“

Alec Jeffreys, 1984
Restrikčné štiepenie genomickej DNA elektroforetická

→

separácia Southernov blotting s VNTR próbou (GGGCAGGAXG)

→

PCR amplifikácia VNTR polymorfizmu

analýza konkrétneho polymorfizmu/lokusu pomocou špecifických

primerov

primery

Multiplex PCR

Amplifikácia viacerých lokusov v jednej PCR reakcii

vľavo - separácia na akrylamidovom géli a vizualizácia striebrom
vpravo - fluorescenčné značenie polymorfizmov a kapilárová elektroforéza

Mikrosatelity variabilita v populácii

Genotypy troch ľudí v štyroch STR polymorfizmoch

(fluorescenčné značenie a kapilárová elektroforéza)

Jedinci

1.

2.

3.

D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO

Identifikácia osôb

Multiplex PCR 16 fluorescenčne značných mikrosatelitových polymorfizmov

Pravdepodobnosť identity dvoch náhodných jedincov 10-17

Polymorfizmy Y-chromozómu a

mtDNA pri štúdiu evolúcie

H.sapiens

Mt a Y-DNA nepodstupuje rekombinácii, polymorfizmy sú

prenášané spolu a tvoria haplotyp so samostatnou históriou,
Dedia sa uniparentálne, poskytujú možnosť sledovať

individuálne maternálne/paternálne línie – migrácie ľudských

skupín,
Mutačná rýchlosť ideálna pre relatívne krátku evolúciu anat.

mod. človeka, umožnuje datovanie recentných udalostí,

osídľovanie kontinentov (SNP, in-del aj STR polymorfizmy),

Štruktúra mtDNA

kruhová 2-vláknová

molekula, 16 569 bp
predstavuje 1/200 000

veľkosti jadrového

genómu
niekoľko 100-1000 kópií

na bunku
Kódujúce oblasti - 93 %

37 tesne usporiadaných

génov
Kontrolná oblasť - 7 %

približne 1200bp

hypervariabilné

segmenty HVSI (CRS:np

16024-16383) a HVSII

(np 57-372)

Štruktúra chromozómu Y

60 Mb dlhá lineárna molekula DNA
95% predstavuje NRY/NRPY – non-recombining region/portion of Y)
Heterochromatín: 6 rôznych typov sekvencii v tandemových zoskupeniach
Euchromatín: X-transponované, X-degenerované a amplikonické segmenty
156 transkripčných jednotiek, 27 proteínových rodín (12 vo všetkých tkanivách,

11 špecifických pre testes)

Polymorfizmy mt a Y-chr. DNA

Polymorfizmy mitochondriálnej

DNA
SNP a in-del polymorfizmy v

kódujúcej oblasti (definujú

haploskupinu) a kontrolnej oblasti

(HVSI a II – definujú haplotyp)
Celková mutačná rýchlosť je asi 10x

vyššia ako v jadrovej DNA, výrazne

varíruje v rámci molekuly
Synonymické pozície a oblasti

HVSI,II sa menia 5-10x rýchlejšie

(1,4x10-6/ bp/gen.) ako

nesynonymické nps génových

oblastí, tRNA a rRNA gény (3,4x10-
7

/bp/gen.)

„mutation hot-spots“ - spätné a

paralelné mutácie (homoplázia)

Polymorfizmy na Y-chromozóme
Bialelické markery (binárne)

SNP, inzerčno-delečné polymorfizmy,

vyskytli sa v evolúcii len raz – definujú

jednotlivé haploskupiny
Nízka mutačná rýchlosť 10-8/báza/

generácia)

Multialelické markery

Mikrosatelity - STR polymorfizmy

(menej ako 10bp) a minisatelity - VNTR

polymorfizmy (10-100bp)
Vysoká mutačná rýchlosť (6,9 x 10-4/

generáciu)
Počet opakovaní – definuje haplotyp
stanovenie diverzity, odhad veku

haploskupiny

Prenos mtDNA, Y-chromozálnej DNA

a autozomálnej DNA

mtDNA a Y-
DNA: žiadna
rekombinácia

prenos „en bloc“
cez generácie

Každý má práve
jedného Y-predka
a jedného mt
predka v každej
predošlej generácii

Pred 5 generáciami mal každý jedinec 2

generáciami mal každý je

5

= 32

predkov, z nich len od jedného zdedil Y, od

predkov, z nich len od jedného zded

jedného mtDNA, ale od všetkých autozomálnu

jedného mtDNA, ale od všetkých autozomál

DNA

DN

Otec

Dieťa

Matka

Koalescencia línií mtDNA a Y-DNA

„mitochondriálna Eva“

Možno nájsť spoločného

predka pre členov

populácie, pretože
v každej generácii dôjde k

zániku a naopak k

zmnoženiu niektorých

línií,
a po čase v rovnovážnej

populácii prevládne mt/Y

DNA odvodené od

jedného spoločného

predka

Rozšírenie H. sapiens – osídľovanie kontinentov

Hypotéza „Out of Africa“

spoločný predok všetkých dnešných ľudí žil v Afrike približne

pred 150 000 rokmi,
posledný spoločný predok pre africké a neafrické mtDNA Y-

DNA žil pred asi 100 000 rokmi – migrácia anatomicky

moderných do Ázie a Európy pred cca 60 – 40 tis. rokmi,
nahradenie populácií H. erectus (H. ergaster, H. heidelbergensis,

H. e. javensis atď) moderným H. sapiens afrického pôvodu,
celá súčasná variabilita mtDNA je najväčšia medzi africkými

populáciami,
všetky ostatné mtDNA typy sú odvodené od pôvodných

haploskupín nájdených v Afrike.

Osídlovanie kontinentov – podľa

mtDNA Y-DNA