Väzbová analýza

a

mapovanie génov

Identifik

Identifi ácia génov



Funkčné klonovanie

- identifikácia génu na základe znalosti proteínu

- identifikácia génu na základe znalosti prote

napr. F-VIII -hemofília A

hemofíl

; PAH gén - fenylketonúria

fenylketonúr

- získanie časti génu sekvenovaním proteínu

- získanie časti génu sekvenovaním proteí

- nev

- ne ýhody: nutnosť poznania proteínu

ýhody: nutnosť poznania prot

purifikácia proteínu, protilátky, cDNA knižnice

purifikácia proteínu, protilátky, cDNA knižni

degenerovanosť genetického kódu

degenerovanosť genetické



Pozičné klonovanie

- identifikácia neznámeho génu určením

- identifikácia neznámeho génu určením

jeho lokalizácie, bez potreby poznania funkcie proteínu

jeho lokalizácie, bez potreby poznania funkcie prote

- nevýhody: analýza DNA viacerých jedincov

- nevýhody: analýza DNA viacerých je

analýza väčších resp. viacerých rodokmeňov

analýza väčších resp. viacerých rodokme

lokusová heterogenita

lokusová heteroge

História mapovania génov

História mapovania gé



Lokalizácia daltonizmu, hemofílie, DMD na X chromozóm na

Lokalizácia daltonizmu, hemofílie, DMD na X chromozóm n

základe dedičnosti

základe dedičn



Metóda chromozómových markerov – lokalizácia Amy2B génu

Metóda chromozómových markerov – lokalizácia Amy2B gé

na 1q

na 1q

„uncoiler“ chromozóm

„uncoiler“ chromo


Metóda štúdia efektu dávky:

Metóda štúdia efektu dáv

trizómie: 150

trizómie:

%,

% chromozómové

chromozómo

delécie 50

écie

% dávky

á



Chromozómová lokalizácia:

Chromozómová lokalizá

- Metóda medzidruhovej hybridizácie somatických buniek

- Metóda medzidruhovej hybridizácie somatických bun


Subchromozomálna lokalizácia:

Subchromozomálna lokalizá

- Hybridizácia buniek s čiastočne deletovanými chromozómami

- Hybridizácia buniek s čiastočne deletovanými chromozóma

- chromosome-mediated gene transfer

- chromosome-mediated gene trans

- Radiačné hybridy a parciálne štiepenie restrikčnými endonukleázami

- Radiačné hybridy a parciálne štiepenie restrikčnými endonukleáza

- FISH

- F

Hybridiz

Hyb

ácia somatických buniek

ácia somatických bun

Hybridizácia ľudských a myších buniek

Vznik nestabilného hybridu,

u ktorého v následných mitózach

dochádza k strate väčšiny ľudských

chromozómov

Možnosť vytvoriť súbor (panel) viac-menej

stabilných hybridných línií obsahujúcich

každý ľudský chromozóm

Monochromozomálne hybridné línie možno

vytvoriť aj priamo fúziou mikrobuniek

(micocell – vznik po pôsobení colcemidu)

Fúzia buniek s chromozomálnymi

Fúzia b

deléciami

Zostavenie kontigov pokrývajúcich celý

chromozóm

Fluorescence in situ hybridization

Fluorescence in situ hybridizati

(FISH)

(FISH

Chromosome painting

Genetické markery



U modelových organizmov mapovanie dvoch

U modelových organizmov mapovanie

fenotypových znakov

fenot

≠J u človeka

≠J u čl



Potreba nových DNA markerov pre mapovanie génov

Potreba nových DNA markerov pre mapovanie

u človeka.

1900

1

krvné skupiny

krvné s

cca 20

cca 2

1960

1

sérové proteíny a izoenzýmy

sérové proteíny a izoenzý

10

1 2

1980

1

DNA RFLP

DNA RFL

10

1 3

1985

1

VNTR - minisatelity

VNTR - minis

10

1 4

1990

1

- mikrosatelity (STR) 10

- mikrosatelity (ST

5

1995

1

SNP (single nt polymorphisms) 10

SNP (single nt polymorphism

6

Informatívnosť polymorfizmov

Informatívnosť polymorfi

1. početnosť a lokalizácia na genóme

1. početnosť a lokalizácia na genóm

- krvné a sérové skupiny – malý počet

- krvné a sérové skupiny – malý počet

- VNTR prevažne v telomerických oblastiach

- VNTR prevažne v telomerických ob

- STR rozptýlené po chromozómoch

- STR rozptýlené

2. informatívnosť polymorfizmov

2. informatívnosť polymorfizm

- RFLP/SNP polymorfizmy majú len 2 alely

- RFLP/SNP polymorfizmy majú len 2 ale

k

heterozygozita H ≠ 1 –

heterozygozita H

Σ xi2

i≠1

(preto takmer ideálne sú STR polymorfizmy s

(preto takmer ideálne sú STR polymorfizmy

vysokým

počtom rovnomerne zastúpených aliel)

počtom rovnomerne zastúpených ali

V súčasnosti využívané

V súčasnosti využívan

polymorfizmy

polymorfiz



STR polymorfizmy

- rozptýlené po celom genóme,

- rozptýlené po celom genóm

- väčší počet aliel ≠› vysoká informatívnosť,

- väčší počet aliel ≠› vysoká inform

- na pokrytie genómu postačuje 400 STR (

- na pokrytie genóm

~ 10cM)

- nevýhodou je absencia „high-throughput“ metódy

- nevýhodou je absencia „high-throughput“ m


SNP polymorfizmy

SNP polymorfi

- takmer vždy len dve alely ≠› nižšia informatívnosť

- takmer vždy len dve alely ≠› nižšia inform

- vyvážené je to ich obrovským počtom (›10

- vyvážené je to ich obrovským počtom

6

)

- „high-throughput“ čipová analýza (až 100 tisíc SNP

- „high-throughput“ čipová a

v jednej analýze)

Meiotický crossing-over

Väzba génov (lokusov)

- voľná kombinovateľnosť – lokusy na rôznych

chromozómoch

- synténia – lokalizácia lokusov na jednom chromozóme

vzhľadom k dĺžke chromozómov sa vzdialené lokusy javia

ako pri voľnej kombinovateľnosti

- väzba lokusov – medzi blízko ležiacimi lokusmi

pravdepodobnosť rekombinácie zavisí od vzájomnej vzdialenosti

Porovnanie fyzickej a genetickej

vzdialenosti

Rekombinačná frekvencia – θ

- je % pravdepodobnosť

meiotickej rekombinácie

medzi dvomi lokusmi

θ ≠ 0 úplná väzba

θ ≠ 0,5 voľná kombinovateľnosť

Závisí od:

Oblasti na chromozóme

ter>cen

pohlavia

ženy > muži

Mapová vzdialenosť

cM – centimorgan

1cM ≠ 1% rekombinácie (θ≠ 0,01)

1cM ~ 1Mb

Viacnásobný cross-over

Vzdialenosť M1 – D ≠ θ

1

Vzdialenosť D- M2 ≠ θ

2

Ale vzdialenosť M1 – M2 ≠J θ

1 + θ2

V skutočnosti je

θ

M1-M2 < θ1 + θ2

V dôsledku dvojitých crossoverov

preto

θ

M1-M2 ≠ θ1 + θ2

platí len pre malé vzdialenosti

Identifikácia rekombinantov v

Identifikácia rekombinanto

rodokmeňovej analýze

rodokmeňovej an

Je potrebné poznať fázu

Analýza trojgeneračných rodokmeňov

Mapovanie génu do oblasti na

Mapovanie génu do oblasti

chromozóme

chromozó

Linkage mapping

Metóda

LOD score:

Testovanie pravdepodobnosti, že dva

sledované lokusy sú vo väzbe k

pravdepodobnosti ich voľnej

kombinovateľnosti

- Väzba pri rekombinačnej frekvencii

θ

- Voľná kombinovateľnosť θ = 0,5

(1- θ)N . θR
Z(θ) = log

10 --------------

0,5 N+R

väzba dokázaná, ak Z>3 (log

10 1000= 3)

väzba vylúčená , ak Z<-2 (log

10 1/100= -2)

Autozygosity mapping

Autozygosity mapping

Autozygosity mapping

Genotypy príbuzných postihnutých v dvoch STR

polymorfizmoch

a) polymorfizmus vzdialený od génu zodpovedného za

ochorenie

b) polymorfizmus ležiaci v blízkosti hľadaného génu

Využitie väzbovej analýzy



Lokalizácia a identifikácia génov

Lokalizácia a identifikácia gén

zodpovedných za dedičné ochorenia,

zodpovedných za dedičné ochore



Využitie v nepriamej DNA diagnostike

Využitie v nepriamej DNA diagnostike

ochorení,

ochor



Identifikácia lokusovej heterogenity

Identifikácia lokusovej heterogen

niektorých ochorení,

niektorých ochor



zostrojenie genetickej mapy celého genómu -

zostrojenie genetickej mapy celého genóm

triangulácia genómu potrebná pre úplné

triangulácia genómu potrebná pre úpl

sekvenovanie genómu

sekvenovanie genó

Informatívne meiózy

Informatívne me

pri nepriamej diagnostike

pri nepriamej diagnos

AD dedičnosť

1. Lokus – ochorenie (gén)

2. Lokus – DNA

polymorfizmus s alelami

A

1, A2, A3, A4

Rodokmene A, B

neinformatívne

Rodokmene C, D

informatívne