Molekulárny aspekt monogénnych ochorení

Typy mutácií, zapríčiňujúcich monogénne ochorenia

Mutácie v kódujúcich sekvenciách

–

model: Hb varianty

Mutácie v nekódujúcich sekvenciách

–

model: talasémie

Nomenklatúra lokusov, alel a mutácií

Lokusová a alelová heterogenita monogénnych

ochorení

Typy mutácií

Triedenie mutácií s patogénnym efektom

Triedenie mutácií s patogénnym efe

1.

podľa zmeny na úrovni DNA

podľa zmeny na úrovni

2.

podľa dôsledkov na štruktúru polypetidu

podľa dôsledkov na štruktúru polype

3.

podľa dôsledkov na funkciu polypeptidu

podľa dôsledkov na funkciu polype

4.

podľa miesta lokalizácie

podľa miesta lokalizáci

1. podľa zmeny na úrovni DNA

1. podľa zmeny na úrov

substitúcie

substit
–

tranzícia - purín > purín alebo pirimidín

rín alebo pirimi

>

pirimidín

pirim

–

transverzia – purín pirimidín

purín pirim

–

najčastejšie

najčastejš tranzícia

tranzí

C > T (8,5 krát)

CpG dinukleotid je mutačné „

CpG dinukleotid je mutačné horúce miesto“

horúce mi

C > metylácia

metyláci > metylc

m

ytozín > deaminácia

deamináci > T

–

ostatné:

ostatné chyby pri replikácii a v oprave DNA

chyby pri replikácii a v oprave DN

delécie (rozsah 1 bp – desiatky Mb)

(rozsah 1 bp – desiatky

–

delécie rozsahu 1 – niekoľko bp často vznikajú v

delécie rozsahu 1 – niekoľko bp často vznikaj

repetitívnych sekvenciách (

repetitívnych se

strand slippage)

strand sl

–

nehomologický crossing-over

nehomologický crossing-ove

–

nehomologická výmena sesterských chromatíd

nehomologická výmena sesterských chrom

duplikácie – v podstate sú opakom delécií

v podstate sú opakom de

–

aj spôsob vzniku

aj sp

–

duplikácia génu

duplikácia gé

PMP22 –

PMP2

Charcot-Marie-Tooth sy.

Charcot-Marie-T

–

delécia génu

delécia g

PMP22 –

PMP2

myopatia HNPP

myopatia HNP

expanzie – zmnoženie krátkej sekvencie o niekoľko

zmnoženie krátkej sekvencie o nie

desiatok až stovák

desiatok až s
–

najčastejšie trinukleotidu (napr CAG pri

najčastejšie trinukleotidu (napr CAG pri

Huntingtonovej chorei

Huntingtonovej chor
•

normálna variabilita:

normálna variabi

do 27 opakovaní

•

premutácia (instabilita):

premutácia (instab

27 – 34 opakovaní

•

variabilná penetrancia

variabilná penetranci : 35 – 39 opakovaní

•

mutácia (patológia).

mutácia (patológi

nad 39 opakovaní

inzercie

–

prerušenie génu inou DNA sekvenciou

prerušenie génu inou DNA sekvenci

–

najčastejšie sú to transpozabilné elementy (nspr.

najčastejšie sú to transpozabilné elementy (nspr

L1 pri hemofílii A)

L1 pri hemofíl

inverzie – otočenie úseku DNA v dôsledku

otočenie úseku DNA v dôs

intrachromozomálnej rekombinácie

intrachromozomálnej rekombinácie
–

dôsledkom je prerušenie génu (50 % prípadov

dôsledkom je prerušenie génu (50 % prí

ťažkej HA je zapríčinených inverziou)

ťažkej HA je zapríčinených inve

fúzované (hybridné) gény

fúzov

vznik – nehomologický crossing-over

vznik – nehomologický cros

- translokácia chromozómov

- transl

t(9;22) > BCR/ABL > chronick

chroni á myeloidná

á myel

leukémia

leuké

génová konverzia –

génová konv

je nerecipročný prenos

je nerecipročný prenos

sekvenčnej informácie z donorovej sekvencie na

sekvenčnej informácie z donorovej sekvencie

akceptorovú sekvenciu

akceptorovú sekvenci
–

najčastejšie z nefunkčného pseudogénu na

najčastejšie z nefunkčného pseudog

fukčný gén

fukčný g

–

dôsledok – vyradenie funkčného génu

dôsledok – vyrade
•

napr

nap SMN1

SMN1 > SMN2 >

> SMN

spin

s

álna svalová atrofia

álna svalová a

2. podľa dôsledkov na štruktúru polypetidu

podľa dôsledkov na štruktúru polypet

substitúcie sa delia:

substitúcie s

–

nemé (silent): - nedochádza zámena

: - nedochádza záme

aminokyseliny

aminokyse

–

meniace zmysel

meniace zm

(missense)

(misse

: zámena

aminokyseliny

aminokyse

–

nezmyselné

nezmy

(nonsense)

(nonse

: vzniká STOP kodón

: vzni

UGC (cysteín)

(cys

(degenerácia kódu)

(degeneráci

UGU

U

(cysteín)

(cysteín)

UAU (tyrozín)

(tyroz

UGA (STOP)

(STO

všeobecne:

všeob

–

STOP mutácie sú závažné

STOP mutácie sú záva

–

závažnosť missenese mut. závisí od toho či postihujú

závažnosť missenese mut. závisí od toho či postihu

funkčne dôležité domény

funkčne dôležité dom

–

aj silent mutácie môžu mať patologický dopad

aj silent mutácie môžu mať patologický do

(aktivácia kriptického zostrihového miesta)

(aktivácia kriptického zostrihového mies

2. podľa dôsledkov na štruktúru polypetidu -

podľa dôsledkov na štruktúru polypetid

pokr

p

.

posunové mutácie

posunové mut

(frame-shift)

(frame

–

úpĺne zmenená sekvencia polypeptidu od bodu

úpĺne zmenená sekvencia polype

mutácie

–

najčastejšie sa však vytvorí

najčastejšie sa však vytvor STOP kodón

–

závažný dopad na funkciu

závažný dopad na funkci

–

na úrovni DNA sú to predovšetkým malé delécia a

na úrovni DNA sú to predovšetkým malé d

inzercie, ktoré nie sú násobkom 3 (kodónu)

inzercie, ktoré nie sú nás

pridanie nových aminokyselín do polypeptidu

pridanie nov
–

inzercie násobku 3 bp

inzer

–

expanzie: napr. „CAG“ kódujúci glutamín u

expanzie: napr. „CAG“ kódujúci glutamí

Huntingtonovej chorei

Huntingtonovej chor

3. podľa dôsledkov na funkciu polypeptidu

podľa dôsledkov na funkciu polypept

.

Z hladiska patológie dôležitý je vplyv na funkciu

Z hladiska patológie dôležitý je vplyv na funkc

polypeptidu a nie zmena na úrovni DNA

polypeptidu a nie zmena na úr

a)

znížená až nulová funkcia (loss-of-function)

(loss-of-functi

b)

nová (abnormálna) funkcia

nová (ab

(gain-of-function)

(gain-of-functio

a) loss-of-function

a) loss-of

–

môže mať rôzne mechanizmy (4. roč.)

môže mať rôzne mechaniz

–

najčastejšie sú recesívne (nie je dôležité presné

najčastejšie sú recesívne (nie je dôležité pre

množstvo produktu, napr. enzýmy – 50 % akt.

množstvo produktu, napr. enzýmy – 50 %
•

haploinsuficiencia

haploinsuficienci – polovičná dávka nestačí

– polovičná dávka nes

•

dominantný negatívny efekt –

dominantný negatívny ef

nefunkčný

polypeptid blokuje produkt normálnej alely

polypeptid blokuje produkt normálnej ale

–

všetky typy zmien na úrovni DNA môžu viesť k

všetky typy zmien na úrovni DNA môžu vi

„loss-of-function“

„loss-of-functi

a) loss-of-function

a) loss-of

– pokr.

všeobecne:

všeobec

–

missense mut., duplikácie, delécia a inzercie neporuš.

missense mut., duplikácie, delécia a inzercie nepor

čítací rámec zachovajú urč. reziduálnu funkciu

čítací rámec zachovajú urč. reziduálnu fun

–

veľké prestavby (delécie, inzercie, inverzie), STOP mut.

veľké prestavby (delécie, inzercie, inverzie), STOP m

úplne eliminujú funkciu alely

úplne eliminujú funkciu a

–

prevažná väčšina mutácií je tohto typu

prevažná väčšina mutácií je tohto t

b)

gain-of-function

gain-of-funct
―

zmenený polypeptid získa novú funkciu

zmenený polypeptid získa novú fun

―

môže mať rôzne mechanizmy (4. roč.)

môže mať rôzne mechanizmy (4. r

―

väčšinou sú to špecifické zmeny na DNA úrovni (exp.

väčšinou sú to špecifické zmeny na DNA úrovni (ex

CAG, hybridný gén)

CAG, hybridný g

―

mutácia je charakteristická pre dané ochorenie (HD,

mutácia je charakteristická pre dané ochorenie (H

CML)

CM

―

nový fenotyp je dominantný

nový fenotyp je dominan

―

v tom istom géne sa môže vyskytnúť mut.“loss-of-

v tom istom géne sa môže vyskytnúť mut.“loss

function“ (delécia

function“ (delé

PMP22

PM

u HNPP) aj „gain-of-function“

u HNPP) aj „gain-of-functio

(duplikácia u CMT)

(duplikácia u CM

4. podľa miesta lokalizácie

a)

v kódujúcich sekvenciách

v kódujúcich sekvenciá

b)

v nekódujúcich sekvenciách

v nekódujúcich sekvenc

b) mutácie v nekódujúcich sekvenciách s

b) mutácie v nekódujúcich sekvenciách

patogénnym dopadom

patogénnym d

mut. vedúce k nesprávnemu zostrihu

mut. vedúce k nesprávnemu zostri
–

priamo v zostrihových miestach

priamo v zostrihových miesta

(splice site m.)

(splice site m

•

v donorovej sekv. (GT)

v donorovej sekv. (G > prepis intrónu do mRNA

prepis intrónu do mR

•

v akceptorovej sekv. (AG)

v akceptorovej sekv. (AG > delécia prísl. exónu

delécia prísl. ex

–

v intrónoch

v intróno

> aktivácia kriptického zostr. miesta

aktivácia kriptického zostr. m

aj nemá mutácia v exóne môže viesť k aktivácii kript.

aj nemá mutácia v exóne môže viesť k aktivácii kript

zostrihového miesta

zostrihového mi

> strata/získanie kódujúcej sekvencie

strata/získanie kódujúcej sekve

mut. v regulačných sekvenciách na

mut. v regulačných sek
–

na 5’ konci

•

v TATA

v T

-, CAAT-boxe, v iných oblastiach

-, CAAT-boxe, v iných ob

promótora, v enhanceroch – ovplyvňujú

promótora, v enhanceroch – ovplyvňuj

rýchlosť transkripcie

rýchlosť transkripci

> znížené množstvo produktu

znížené množstv

–

na 3’ konci

•

mutácie poly(A) signálu – nestabilná mRNA

mutácie poly(A) signálu – nestabilná mR

> znížené množstvo produktu

znížené množstv

OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/

Nomenklatúra lokusov a alel

Gény: skratka hlavnej funkcie alebo génového produktu (píšu sa

kurzívou)

–

HBA1

hemoglobín alfa, lokus 1

–

COL5A2 kolagén typ 5, alfa 2 polypeptid

Pseudogény: symbol génu + „P“ (staršie označenie ψ)

–

HBAP1

pseudogén globínového génu alfa 1 (alebo ψHBA1)

–

ACTBP2

druhý pseudogén aktínového génu beta

„Anonymné“ úseky DNA: symboly „D“

symboly: 1-22; X; Y – chromozóm

N

- na viacerých chromozómoch

S

- jednotková sekv. („single copy“)

Z

- repetítívna sekv. na jednom

chromozóme

F

- repetítívna sekv. na viacerých chrom.

(„family“)

- D14S63 - 63. identifikovaný úsek DNA na chromozóme 14

- DXS12 - 12. identifikovaný segment chromozómu X

- DNF3 - 3. identifikovaná rodina repet. sekvencií na viacerých

chromozómoch

Nomenklatúra mutácií

Substitúcie aminokyselín:

–

používajú sa jedno- alebo trojpísmenkové symboly

•

X – znamená STOP kodón

•

niekedy sa používa „p.“ , že sa jedná o polypeptid

•

napr. p.R117H alebo Arg117His > substitúcia arginínu za

substitúcia arginínu z

histidín v pozícii 117 polypeptidu

histidín v pozícii 117 polypep

•

G542X

G542X > glycín v poz. 542 nahradený STOP kodónom

glycín v poz. 542 nahradený STOP kod

Substitúcie nukleotidov:

–

niekedy sa začína:

•

„g.“ – pre genomickú sekvenciu

•

„c.“ – pre cDNA

–

A z iniciačného kodónu (ATG) je vždy +1 (báza pred ním je -1)

–

číslovanie sa vzťahuje na „sense“ vlákno

–

intróny sa označujú ako „IVS“ plus jeho číslo

–

alebo pozíciou posledného nukleotidu v exóne plus („+“) pozícia

subst.

príklady:

–

g.1162G

>A – substitúcia guanínu za arginín v poz. 1162

A – substitúcia guanínu za arginín v poz. 11

genom. DNA

geno

–

g.621+1G

>T alebo

aleb IVS4+1G

IVS4+1 >T – subst. guanínu za tymín v 1.

T – subst. guanínu za ty

pozícii intrónu 4

pozícii intrónu

Nomenklatúra mutácií – pokr.

delécie a inzercie:

–

„del“ – skratka pre deléciu (staršie označenie „

– skratka pre deléciu (staršie označenie Δ“)

–

„ins“

„ins – skratka pre inzerciu

– skratka pre inzerc

delécia aminokyseliny:

delécia aminokyselin

–

F508del

F508

(ΔF508) – delécia fenylalanínu v pozícii 508

F508) – delécia fenylalanínu v pozícii 50

delécia nukleotidu (nukleotidov)

delécia nukleotidu (nukleotid

–

c.6232_6236del

c.6232_623

alebo

aleb 6232_6236delATAAG –

6232_6236delATAA

delécia 5

delécia 5

nukleotidov (môžu byť špecifikované) počínajúc nt. 6232 z

nukleotidov (môžu byť špecifikované) počínajúc nt. 6232

cDNA

–

g.409_410insC

g.409_410ins – inzercia C medzi nt. 409 a 410 genómovej

– inzercia C medzi nt. 409 a 410 genómove

DNA

„Základná www stránka:

www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature

Globínové génové rodiny α a β

Chromozóm 16

Chromozóm 11

kb

Štruktúra globínových génov

α-globínový gén

β-globínový gén

chr. 16

chr. 11

Expresia Hb génov v ontogenéze

Typy hemoglobínu

Typy hemoglobí

embryon

mbry álny

áln HbE

H

= ζ2 ε2

fetálny

á

HbF

H = α

2 γ2

adultný typ A,

adultný typ

HbA

H

= α2 β2

adultný typ A

adultný t

2, HbA

H

2 = α2δ2

Hb molekula:

Hemoglobinopatie: zmeny štruktúry alebo kvantity

Hb reťazcov

abnormálne hemoglobíny

(zmena štruktúry)

HbS: kosáčiková anémia

beta-globínový gén

Glu6Val

HbC: Glu6Lys

HbE: Glu26Lys

HbD: Glu121Gln

a niekoľko 100 ďalších

príčinou je mutácia v

kódujúcej sekvencii

talasémie (väčšinou zmena

intenzity syntézy)

nulová tvorba Hb polypeptidu

znížená tvorba Hb polypeptidu

nevyvážená tvorba

polypeptidov

talasémie: alfa

beta

typy: „nula“ (α

0 alebo β0)

„plus“ (α+ alebo β+)

príčinou je najčastejšie

mutácia mimo kódujúcej

sekvencie

Mutácia Glu6Val (E6V) v beta-globínovom géne a

kosáčiková anémia

Normálne erytrocyty

Kosáčikové erytrocyty
(KE)

Prvý dôkaz, že substitúcia nukleotidu vedie k substitúcii
aminokyseliny v génovom produkte

Mutácia Glu6Val (E6V)

pleiotropia –jedna mutácia a viac fenotypových prejavov

Glu6Val

abnormálny Hb

anémia

rýchly rozpad KE

zhlukovanie KE v cievach

abnormálne erytrocyty (KE)

ukladanie KE v slezine

lokálne nedostatky v zásobovaní krvou

celková slabosť

zhorš. mentálne funkcie

rozšírenie srdca

zlyhanie srdca

poškodenie srdca

p. pľúc

p. obličiek

pneumónia

zlyh. obličiek

zväčš. slezina

Typy mutácií vedúcich k talasémii 1

Term. (skrátia Hb-reťazec)

. . . 37 38 39 40 . . . pozícia AA

. . .His Lys Tyr His . . normálny beta-reťazec

. . CACAAGUAUCAC. . mRNA

. . CACAAGUAA mRNA s mutáciou

. . His Lys stop

β

0 -talasémia

Term. (predĺžia reťazec)

. . . . . . . .. . UAA (stop)

C A G C

Gln Lys Glu Ser + ďalšie AA C-S talasémia

Hb Constant Spring

Typy mutácií vedúcich k talasémii 2

Frameshift

. . . Ser Ile Thr Lys . . . normálny beta-reťazec
. . AGU AUC AGU AAC . . mRNA
del
. . AGU AUC UAA stop
. . Ser Ile koniec reťazca

β

0- talasémia

Poruchy zostrihu (mutácie v akcept. a donor. signálnych sekv.)

GT... ...AG

beta-globínový gén

.. . GTGGTTGGT..

...GTGATTGGC..

β

0

β+

β

0 alebo β+ talasémie

Typy mutácií vedúcich k talasémii 3

Vznik zostrihového signálu v intróne alebo v exóne

β-globínový gén

GT....

..TTAG

TTGGTTC

..TTAGTTC..

nová akceptorová signál. sekvencia

v intróne:

zostrih v intróne

mRNA (obsahuje časť intrónu)

β+ talasémia

vystrihne sa ako
intrón

Typy mutácií vedúcich k talasémii 4

Mutácie v 5´-signálnych sekvenciách (TATA box, CAAT box...)

5´. . . T A T A. . . .

5´. . . T A

. .3 ´

. . TATG . . . zníženie intenzity transkripcie β+ talasémia

• Mutácie v poly-A signále

(AATAAA)

5´. . . .

AATAAA . . . 3´ norm. α- gén

G nevznikne poly (A)

znížená stabilita mRNA

α+ talasémia

Typy mutácií vedúcich k talasémii 5

Delécie globínových génov (najmä u alfa-globínov)

... 3´ α-globínová rodina

ζ

ψζ

ψα

α2

α1

Známe delécie (výber):

αα

-α3,7

-α4,2

- α5,2

--SEA

--MED

Stupeň závažnosti závisí od toho, koľko alfa-génov delécia vyradí a či je jedinec
heterozygot alebo homozygot (4ά – zdravý, 3 ά – prenášač, 2 ά – mierna talasémia,
1 ά – stredne ťažká t., 0 ά – letálna talasémia

5´. .

5´

Typy mutácií vedúcich k talasémii 6

Mutácie v promotorovej oblasti:

beta-globínový gén

-116

-90

-75 „CAAT“ -30 „TATA“

I.exón

5´... CCTCACCCT . . CACACCCTA . . TTGGCCAATCT . ..GTATAAAAGT...........

mutácie: T TG GGAG
Dôsledok: rôzny stupeň redukcie množstva génového produktu →rôzne β+

talasémie

Mutácie vo vzdialených sekvenciách („enhanceroch“):
-16 kb

. . . delécia ...... / / .......... βglobínová rodina bez mutácie

Dôsledok: žiadna expresia génov! – chýba DCR – „dominant control region“

→

β

0 talasémia

Hemoglobinopatie: záver

Veľká lokusová heterogenita

Obrovská alelová heterogenita

- často pri rovnakom fenotypovom (klinickom) prejave

Väčšina mutácií s fenotypovým (klinickým) prejavom je

priamo v géne alebo v jeho tesnej blízkosti (regulačné

sekvencie): dôsledok pre génovú terapiu a transgenézu

Model pre iné monogénne ochorenia