DNA diagnostika

Klasická dg

Klasická

.

metódy biochemické

metódy biochemi

funkčné a
morfologické dôsledky chybného génu

morfologické dôsledky chybného

Obmedzenia klasickej dg.

ontogenetická špecifita

ontogenetická špe

tkanivová špecifita

tkanivová špe

neprítomnosť príznakov u heterozygotov

neprítomnosť príznakov u heterozygo

heterogenita

hetero

DNA diagnostika

Analýza DNA

Analý

Nezávislosť od ontogenézy -

Nezávislosť od ontogenézy - predklinická a prenatálna

predklinická a prenatál

dg.
Nezávislosť od tkaniva –

Nezávislosť od tkani

leukocyty, choriové klky,

leukocyty, chorio

plodová voda, parafínové bločky

plodová voda, parafínové bl

Detekcia heterozygotov

Detekcia heterozygot

Diferenciálna dg. -

Diferenciálna dg neurodegeneratívne a

neurodege

nervovosvalové ochorenia, FRA-X, nesyndrómová

nervovosvalové ochorenia, FRA-X, nesyndró

hluchota, ....

hluchota, .

Citlivosť –

Citlivos

preimplantačná dg. po in vitro fertilizácii

preimplantačná dg. po in vitro fertilizác

Rýchlosť

Rýchl

Jednotná metodika

Jednotná me

DNA diagnostika

Informácie z analýzy DNA:

prítomnosť resp. neprítomnosť špec. úseku DNA
dĺžka tohto úseku
sekvenčné zloženie tohto úseku (do určitej miery)

Spôsoby DNA diagnostiky

Spôsoby DNA diagnost

1. Priama DNA dg.

1. Priama DNA dg

2. Nepriama DNA dg

2. Nepriama DNA

.

1. Priama DNA diagnostika

Princíp:

Princíp

detekcia mutácie v príslušnom géne

detekcia mutácie v príslušnom gé

zodpovednej za ochorenie

zodpovednej za ochor

Podmienky priamej DNA dg.:

Podmienky priamej DNA d

detailné znalosti o príslušnom géne

detailné znalosti o príslušnom g

znalosť mutačného spektra

znalosť mutačného spe

znalosť distribúcie mutácie v danej

znalosť distribúcie mutácie v da

populácii

populá

Výhody priamej DNA dg.:

Nulové riziko rekombinácie

Nulové riziko rekombiná

Vyšetrenie len pacienta

Vyšetrenie len pacien

Priama detekcia prenášačov

Priama detekcia prenáša

Diferenciálno-diagnostická hodnota

Diferenciálno-diagnostická hodno

(heterogenita)

(heterogen

Obmedzenia:

Detailné znalosti o príslušnom géne

Detailné znalosti o príslušnom g

Veľký počet mutácií (napr. CF)

Veľký počet mutácií (napr. C

A. Delécie -1 bp až 10 – 100 bp

prejav na DNA úrovni

a. Skrátený fragment –

a. Skrátený fragme

Príklad:

Príklad Cystická fibróza (CF)

Cystická fib

Dedičnosť:

Dedič

AR

Metóda: PCR

Metód

96 bp

99 bp

B. Substitúcie – bodové mutácie

R408W

mutácia vytvorí restrikčnné miesto

R261Q

mutácia eliminuje restrikčné miesto

IVS12nt

ACRS – PCR vytvára RM pre restriktázu –

štiepia sa alely bez mutácie

Príklad – fenylketonúria (PKU)

Dedičnosť - AR

Názov mutácie

B. Substitúcie – bodové mutácie

Príklad: Primárny kongenitálny glaukóm (PCG), mutácia E 387K

Dedičnosť: AR

Metóda: PCR s alelovo-špecifickými primermi (ARMS)

M – PCR s mutáciou

N – PCR bez mutácie

?

M N M N M N M N M N M N neg. kon.

Kontrolný fragment

Analýza mutácii v CF géne pomocou kitu Elucigene

CF 29

PCR prebieha v 4 reakciách – analýza 29 najčastejších mutácií

PCR prebieha v 4 reakciách – analýza 29 najčastejších mutác

Metóda –Multiplex ARMS test

Metóda –Multip

R 117H

Kontrolné fragmenty

Mutácie

A B C D

Delta F 508

10 kb

11 kb

12 kb

Marker

9,5 kb

prejav – zmenená dĺžka fragmentov

metóda detekcie - PCR

D. Inverzie – Hemofília A, dedičnosť - XR

F. Prítomnosť špecifickej sekvencie

XX

XY

106 bp X

112 bp Y

Pohlavie – X a Y špecifické sekvencie

metóda detekcie - PCR

SM

SM

2. Nepriama DNA diagnostika

Princíp:

Princíp identifikácia a sledovanie segregácie mutácie v

identifikácia a sledovanie segregácie mutáci

danej rodine pomocou úzko viazaného DNA

danej rodine pomocou úzko viazaného DN

polymorfizmu

polymorfi

Potrebné informácie

Potrebné inform

modelové (typ dedičnosti daného ochorenia, AD, AR,

modelové (typ dedičnosti daného ochorenia, AD,

XR..)

špecifické informácie – získané analýzou DNA

špecifické informácie – získané analýzou DN

polymorfizmu v danej rodine (fáza väzby)

polymorfizmu v danej rodine (fáza väzb

Podmienky nepriamej DNA dg.:

Podmienky nepriam

genetická homogenita a jednoznačná klinická dg. –

a jednoznačná klinická dg

kauzálne mutácie v tom istom géne

kauzálne mutácie v tom istom

informatívnosť rodiny – možnosť stanovenia

informatívnosť rodiny – možnosť stanoveni

väzbových vzťahov v rodine (

väzbových vzťahov v rodine určiť ktorá alela

určiť ktorá al

polymorfizmu je asociovaná s mutáciu v danej rodine

polymorfizmu je asociovaná s mutáciu v danej

)

úzka väzba s polymorfizmom (do 5 cM)

úzka väzba s polymorfizmom (do 5

Autozomálne

Autozom

recesívny

reces

typ dedičnosti

typ dedičnost

Princíp nepriamej DNA diagnostiky

d

M2

D

M1

D

M1

d

M2

d – mutovaná alela

D – normálna alela

M1,M2 – alely
polymorfizmu

d

M2

d

M2

D

M1

D

M1

Autozomálne

Autozom

dominantný typ dedičnosti

typ dedičnost

Princíp nepriamej DNA diagnostiky

D

M1

d

M1

D

M1

d

M1

d

M2

D – mutovaná
alela

d – normálna
alela

M1,M2 – alely
polymorfizmu

d

M1

d

M2

X recesívny typ dedičnosti

typ dedičnost

Princíp nepriamej DNA diagnostiky

d – mutovaná
alela

D – normálna
alela

M1,M2 – alely
polymorfizmu

D

M2

d

M2

D

M1

?

?

d

M2

D

M2

?

?

?

D

M1

D

M2

d

M2

Výhody nepriamej DNA dg.

Aplikácia pri ochoreniach, u ktorých nepoznáme ich

Aplikácia pri ochoreniach, u ktorých nepoznáme

molekulárnu podstatu ani gén, ktorý mutuje

molekulárnu podstatu ani gén, ktorý mutuj

Stačí, ak sa stanoví väzba ochorenia s určitým DNA

Stačí, ak sa stanoví väzba ochorenia s určitým DN

polymorfizmom

polymor

Pri niektorých ochoreniach je jedinou metódou DNA

Pri niektorých ochoreniach je jedinou metódou DN

dg. (veľa mutácií rôzneho typu)

dg. (veľa mutácií rôzneho typ

Nevýhody nepriamej DNA dg.

Nestačí len vyšetrenie pacienta

Nestačí len vyšetrenie pacie

Dg. možná až po stanovení genetickej väzby

Dg. možná až po stanovení genetickej väzb

Riziko rekombinácie

Riziko rekombináci

Princíp rekombinácie

M1

Rekombinančná frekvencia – miera vzdialenosti 2

lokusov

D

d

M2

D

M1

d

M2

D

M2

d

M1

rodič

meióza

gaméty

1 cM = 1%

rekombinančnej

frekvencie

Príklady informatívnosti rodín pri nepriamej

DNA dg.

Autozómovo dominantná dedičnosť

Autozómovo dominantná dedičnos

polymorfizmus

informatívny čiastočne informatívny neinformatívny

VNTR

STR

AD – úplne informatívna rodina

A

B

AD – čiastočne informatívna rodina

?

?

A

B

AD – neinformatívna rodina

?

Príklady informatívnosti rodín pri nepriamej DNA

dg.

Autozómovo recesívna dedičnosť

Autozómovo recesívna dedičnos

informatívny čiastočne informatívny

neinformatívny

AR – úplne informatívna rodina

B

A

AR – čiastočne informatívna rodina

?

?

?

A

C

B

Zdravý-

prenášač?

Postihnutý-

alebo

prenášač?

Zdravý-

prenášač?

Postihnutý-

alebo

prenášač?

Post. alebo

zdravý?

AR – neinformatívna rodina

?

?

B

A

Zdr., post., prenášač?

Zdr., post., prenášač?

XR – rodina úplne informatívna

A

B

XR – neinformatívna rodina