•

patrí

k najprogresívnejším

molekulárno-biologickým

metódam so širokým spektrom využitia

•

umožnila rozvoj vedných disciplín ako humánna
a veterinárna medicína, genetika človeka, rastlín
a mikroorganizmov, archeológia, kriminalistika a pod.

•

najvýznamnejší objav 80-tych rokov

•

autor metódy - Kary Mullis z firmy Cetus Corporation
(California, USA)

Polymerázová reťazová reakcia (PCR - Polymerase

chain reaction)

• do komerčnej podoby bola prepracovaná kolektívom vedeným Henry

Erlichom

• rok 1985 - prvýkrát publikovaná praktická aplikácia metódy pri analýze

ľudského β-globínového génu a diagnostiky kosáčikovej anémie

• časopis Science udelil v roku 1989 metóde titul – objav roka
• v roku 1993 získal jej autor Nobelovu cenu za chémiu

Princíp metódy:

• umožňuje selektívne namnožiť - naamplifikovať požadovaný

úsek DNA v skúmavke do miliónového počtu kópií

• metóda napodobňuje replikáciu DNA počas bunkového

delenia

• zatiaľ čo pri replikácii DNA sa replikuje celý chromozóm za

vzniku dvoch identických kópií, pri PCR in vitro sa replikuje
špecifický úsek DNA, ktorý vymedzujú krátke oligonukleotidy –
primery, do miliónov kópií

• amplifikácia DNA v PCR je cyklický proces, opakovanie 3

krokov (20-40x): denaturácia dsDNA, hybridizácia – pripojenie
primerov a polymerizácia – syntéza nových vláken

• Primery (syntetické

jednovláknové
oligonukleotidy dĺžky 17 - 25
báz) svojou polohou
vymedzujú amplifikovaný
úsek na DNA, pričom prvý
primer sa viaže na jedno
vlákno DNA, druhý sa viaže
na vlákno komplementárne v
denaturovanej DNA

Polymerizácia DNA = extenzia

DNA

• termostabilná DNA

polymeráza syntetizuje nové
vlákna DNA

Hybridizácia primerov = annealing

• V jednom cykle sa počet molekúl DNA zdvojnásobí
• V každom nasledujúcom cykle slúži pôvodný templát a podľa neho

nasyntetizované kópie ako predlohy pre vznik ďalších produktov
reakcie

• Výsledkom je amplifikácia pôvodného počtu kópií cieľového

úseku DNA 2n krát (kde n = počet cyklov)

•

PCR sa uskutočňuje vtedy, ak sú v reakčnom prostredí prítomné nasledovné
zložky: DNA polymeráza, tlmivý roztok, deoxyribonukleozidtrifosfáty (dNTP-
dATP, dGTP, dCTP, dTTP), primery a templátová DNA, Mg2+ ióny

Základné zložky PCR:
Termostabilná DNA-polymeráza

 kľúčový enzým celého procesu
 Jej aktivita pri vysokých teplotách PCR podstatne ovplyvňuje výťažok reakcie.
 Pôvodne sa na amplifikáciu DNA používal Klenowov fragment DNA polymerázy

I z Escherichia coli, ktorý bolo nutné pridávať do reakčnej zmesi v každom
cykle, pretože sa vysokou teplotou pri denaturácii inaktivoval.

 Zdokonalenie metódy PCR umožnil objav termostabilných DNA

polymeráz izolovaných z termofilných baktérií, ktoré si zachovávajú aktivitu
dostatočne dlho aj pri vysokých teplotách.

• Najznámejšia a najpoužívanejšia je Taq DNA polymeráza izolovaná

z termofilnej baktérie Thermus aquaticus, odolná voči teplotám do
95° C

• Taq DNA polymeráza nemá 3´- 5´opravnú exonukleázovú aktivitu,

čo spôsobuje chyby pri polymerizácii, predovšetkým jednobázové
substitúcie

• Okrem Taq DNA polymerázy sú komerčne dostupné aj iné

termostabilné DNA polymerázy : Stoffelovej fragment DNA
polymerázy vykazuje lepšiu teplotnú stabilitu, VENTR™ DNA
polymeráza izolovaná z Thermococcus litoralis má 3' - 5'
exonukleázovú aktivitu, preto pracuje s menšou chybou než Taq
polymeráza. Je vhodná najmä pre presnú syntézu dlhších úsekov
(niekoľko kilobáz). Pfu polymeráza (Pyrococcus furiosus) sa
vyznačuje vyššou presnosťou i termostabilitou.

Tlmivý roztok = reakčný roztok= PCR buffer
• obsahuje 50 mmol.l-1 KCl, 10 mmol.l-1 Tris-HCl (pH=8,5 pri

25°C) a 1,5 mmol.l-1 MgCl2

dNTP

200 mmol.l-1 zmes deoxynukleozidtrifosfátov (dNTP - dATP, dCTP,
dGTP, dCTP), 0,1-0,01 mmol.l-1 primery a l - 2,5 U DNA polymerázy

MgCl2

Koncentrácia Mg2+ iónov má najvýraznejší vplyv
na špecifitu amplifikácie.

•

Za optimálnu sa považuje koncentrácia 1-2
mmol.l-1

•

Nadbytok

Mg2+

vedie

k

akumulácii

nešpecifických produktov, nízka koncentrácia
redukuje alebo úplne eliminuje výťažok
reakcie.

Primery
Výber správnej sekvencie primerov je podmienkou pre úspešný priebeh
amplifikačnej reakcie, chybný návrh sekvencie primerov vedie k úplne neúčinnej
alebo nešpecifickej amplifikácii.

Pri návrhu primerov je potrebné dodržať niekoľko základných
požiadaviek :

*

musia hybridizovať na jednotlivých reťazcoch 3' koncami oproti sebe a

tak ohraničovať úsek určený na amplifikáciu

* dĺžka primerov sa pohybuje v rozmedzí 18 – 25 báz; u kratších
primerov je pomerne vysoká pravdepodobnosť hybridizácie s inými
miestami templátu, u dlhších potom reasociácia trvá pomerne dlho a jej
teplota musí byť vyššia, čo nie je vždy výhodné

* teplota topenia (Tm) primerov by mala byť rovnaká alebo čo najviac
podobná a dostatočne vysoká, aby zabezpečila hybridizáciu v rozsahu
teplôt okolo 45°C-60°C, ale zároveň uchovala hybrid stabilný pri teplote
polymerizácie (72 °C)

• obsah G a C by mal byť zhodný a mal by sa pohybovať v

rozsahu 40-60 %

• primery by mali byť prísne komplementárne k sekvencii

templátu na 3' konci primeru (počiatok polymerizácie),
na 5' konci naopak môžu byť modifikované.

• Doporučuje sa, aby 3' koniec obsahoval 2-3 guanínové

alebo cytozínové nukleotidy.

• Na druhej strane primery nesmú byť navzájom

komplementárne, pretože vznikajú tzv. primer-diméry

• Teplota a čas annealingu závisia od bázového zloženia,

dĺžky a koncentrácie primerov.

• Teplota annealingu (TA) by mala byť o 5 – 10 °C nižšia

ako Tm (teplota topenia) hybridu primer-templát

• Navrhovanie primerov - program OLIGO alebo PRIMER 3
• Primery za určitých podmienok tvoria tzv. primer-diméry
• Presný mechanizmus ich tvorby nie je celkom objasnený.

Primer-diméry sa objavujú, ak jeden primer je predlžovaný
viac ako druhý, ak je málo iniciačného templátu a veľa
PCR cyklov. Tvorbu primer-dimérov možno minimalizovať
použitím nižšej koncentrácie primerov a enzýmu.

Templátová DNA

• PCR je možné uskutočniť pri použití templátovej DNA z jednej

bunky

• pri prekročení určitej koncentrácie DNA účinnosť PCR klesá

• čistota DNA zvyšuje špecifitu reakcie

Inhibítory PCR - inhibujú Taq polymerázu :

hemoglobín a hematín v krvi

melanín prítomný v bunkách chlpov

chelatačné činidlá ako EDTA, ktoré viažu Mg2+ ióny
potrebné pre amplifikačnú reakciu a iónové detergenty
(SDS)

Teplotný režim a počet cyklov

Teplotný režim ovplyvňuje úspešnosť amplifikácie a výťažok PCR
produktu.

teplota denaturácie je 90 - 95° C (94°C za 1 min.)

vyššia teplota denaturácie sa odporúča pre DNA s vyšším obsahom G
- C párov

teplota annealingu (TA) - hybridizácie primerov a templátu, závisí od
nukleotidového zloženia primerov, ich dĺžky a koncentrácie (50-60°C)

teplota polymerizácie - 60 - 75°C (štandardne 72°C)

Annealing a polymerizácia : 30 sek. – 2 min.

výnimka : syntéza dlhších fragmentov (viac ako 1kb), kde sa vyžaduje
predĺženie času polymerizácie (1 min. na 1 kb)

Optimálny počet cyklov závisí od koncentrácie jednotlivých zložiek PCR a
pohybuje sa v rozsahu 25 – 35 cyklov. Nedostatočný počet cyklov má za
následok nízky výťažok amplifikácie, na druhej strane príliš veľa cyklov
zvyšuje pravdepodobnosť nešpecifických produktov.

PCR režim sa naprogramuje do automatických programovateľných

prístrojov - termocyklerov, ktoré zabezpečujú striedanie teplôt v
krátkych časových úsekoch. Trvanie : 1-4 hodiny

Špecifita amplifikácie

Špecifitu amplifikačnej reakcie určuje správny výber primerov.

Príčiny tvorby nešpecifických produktov :

• nešpecifická hybridizácia primerov (mispriming), ktorú možno
obmedziť znížením koncentrácie primerov, Mg2+, množstva
enzýmu a zvýšením TA

• aktivita polymeráz pri laboratórnej teplote - udržiavanie PCR mixu
pred denaturáciou pri nízkych teplotách a predhrievanie
termocyklera na teplotu denaturácie pred vložením vzoriek.

Špecifitu polymerizácie je možné zvýšiť použitím tzv. vnútorných
primerov (nested priming), ktoré zabezpečujú amplifikáciu
vnútorného úseku cieľovej sekvencie v ďalšej PCR

Kontaminácie v PCR

Vysoká citlivosť PCR spôsobuje možnosť kontaminácie.

Opatrenia:

•

separovať priestory pre izoláciu DNA, prípravu PCR a analýzu

produktu PCR,

•

pracovať v priestoroch, ktoré je možné vyžiariť ÚV svetlom,

•

používať jednorázový materiál (rukavice, sterilné

mikroskúmavky a špičky s filtrom),

•

reagenty uchovávať v malých častiach, v ideálnom prípade na

jedno použitie

•

vyhýbať sa tvorbe aerosólov (skúmavky pred otvorením krátko

centrifugovať)

•

používať negatívnu kontrolu (bez DNA), ktorá slúži na

monitorovanie kontaminácie,

•

DNA do reakčnej zmesi pridať na záver a ihneď uzatvoriť

skúmavku

Identifikácia a analýza produktov PCR
Produkty PCR analyzujeme elektroforeticky

Výber typu nosiča – gélu ( agaróza alebo polyakrylamid) závisí od veľkosti
fragmentov, ktoré chceme separovať

Vizualizácia fragmentov je možná pomocou transiluminátora s UV žiarením

Veľkosť produktu zistíme pomocou štandardných DNA markerov
molekulových hmotností

204 bp

91 bp

M

♂ ♀

1 2 3 4 5 6 N

M - marker molekulovej hmotnosti pBR322/Hae III; N - negatívna kontrola

Nested PCR

• založená na amplifikácii sekvencií génov v rámci externej a internej PCR
• využitie dvoch druhov primerov, ktoré umožňujú dosiahnuť vyššiu

špecifitu amplifikácie

časť primárneho
produktu PCR získaného
pomocou vonkajších
primerov je následne
amplifikovaná pomocou
vnútorných primerov,
viažucich sa na vnútorný
úsek primárneho
produktu

REAL-TIME PCR

• monitoring PCR produktov v čase ich tvorby, t.j. v reálnom čase
• umožňuje priamu kvantifikáciu PCR produktu v priebehu reakcie
• využitie fluorescenčných sond al. farbív, ktoré detekujú množstvo PCR

produktu behom reakcie zvýšením fluorescenčnej aktivity

• fluorescencia je meraná behom každého cyklu PCR a jej intenzita je

priamo úmerná množstvu PCR produktu prítomného v reakčnej zmesi

AS PCR (alelovo-špecifická amplifikácia)

• umožňuje detekciu bodových mutácií a malých

delécií využitím alelovo špecifických primerov so

sekvenciou na 3′OH konci korešpondujúcou

s miestom mutácie

• pre každú vzorku DNA sa robia dve PCR reakcie
• v prvej reakcii sa používa primer špecifický pre

mutovanú alelu, v druhej primer špecifický pre

štandardnú alelu

• Amplifikácia prebehne len keď existuje perfektná

komplementarita medzi DNA templátom

a špecifickým primerom.

PCR RFLP

RFLP (Restriction Fragment Lenght polymorphism = polymorfizmus

dĺžky restrikčných fragmentov)

• metóda využíva schopnosti restrikčných endonukleáz, ktoré

rozpoznávajú špecifické sekvencie (tzv. cieľové miesto) na ds DNA

a štiepia obe vlákna v rozpoznanej sekvencii

• Cieľová sekvencia – 4-8 nukleotidov

• v dôsledku mutácie vzniká alebo zaniká štiepne miesto pre

restrikčnú endonukleázu, detekuje sa rôzny počet fragmentov

• Názvy restrikčných endonukleáz sú odvodené od názvu

bakteriálneho kmeňa, z ktorého bol príslušný enzým izolovaný

(napr. EcoRI je z kmeňa Escherichia coli)

PCR-RFLP

1. ODBER VZORIEK





2. IZOLÁCIA DNA

VZORKA LYZAČNÝ ROZTOK





DNA


3. PCR
CIEĽOVÁ SEKVENCIA
_______________________ TEMPLÁT DNA



MILIÓNY KÓPIÍ
______________ CIEĽOVEJ SEKVENCIE


4. RESTRIKČNÁ ANALÝZA

______________




_____ _________ ______________


5. ELEKTROFORÉZA A VYHODNOTENIE

CYKLER

37°C