5

Izolácia DNA, gélová elektroforéza

a vizualizácia nukleových kyselín

DNA predstavuje menej než 1% z celkovej bunkovej hmotnosti. Až 22% pripadá na bielkoviny a 3% na lipidy. Bežné izolačné metódy sú kombináciou extrakcie a zrážania DNA alebo izolácie
pomocou kolóniek.

FENOL - CHLOROFORMOVÁ IZOLÁCIA

1. Rozbitie buniek:

Lýza bunkových membrán sa dosiahne pomocou detergentov, ktoré pomáhajú rozpúšťať lipidy
bunkových membrán a denaturujú bielkoviny. Najčastejšie používaným detergentom je SDS (sodium
dodecyl sulfát), Triton X-100.

2. Odstránenie bielkovín:
e) pomocou organických rozpúšťadiel (fenol, chloroform)

Nukleové kyseliny sú hydrofilné molekuly, ktoré sa dobre rozpúšťajú vo vodnej fáze. Bielkoviny vďaka
prítomnosti hydrofóbnych skupín sú lepšie rozpustné v organickej vrstve (spodná). Po intenzívnom
pretrepaní sa vzorka centrifuguje a vytvoria sa dve fázy. Vrchná vodná fáza obsahuje rozpustené
nukleové kyseliny. Ak sa pridá k fenolu chloroform, nukleové kyseliny sa podstatne menej dostanú do
organickej vrstvy, zatiaľ čo bielkoviny sa hromadia v interfáze.

b) pomocou enzýmov

Na deproteinizáciu sa použijú proteázy – proteináza K alebo pronáza. Nevýhodou je, že sa dá odstrániť
iba 80 až 90 % proteínov. Zvyšok bielkovín sa odstráni vyššie uvedenou extrakčnou procedúrou.

3. Odstránenie RNA: kontaminujúca RNA sa dá odstrániť pomocou enzýmu ribonukleázy, ktorá degraduje

molekuly RNA na malé fragmenty.

4. Vyzrážanie DNA: DNA sa zráža v etanole alebo izopropanole a pridaním soli (NaCl, Na-acetát). Získaný

sediment DNA sa rozpustí v sterilnej vode.

IZOLÁCIA DNA POMOCOU KOLÓN

Princíp metódy je založený na zachytení DNA na kolónkach, ktoré obsahujú silikagély alebo anión
iontomeničové živice. Na izoláciu stačí 0,2 ml nezrazenej krvi.

3. Rozbitie buniek: proteináza K narušuje bunkové steny a napomáha rozrušenie buniek. Lyzačný roztok,

obsahujúci chaotropné soli a detergent rozbíja otvorené bunky. Intenzívne premiešanie a teplota 65 oC
napomáhajú lýze membrán a natráveniu bielkovín.

2.

Zachytenie DNA na membráne kolónky: DNA sa viaže na kremičitú membránu kolónky, nežiadúci

bunkový materiál, denaturované proteíny a RNA sa odstránia pretečením kolónkou.

3. Premývanie a odstránenie kontaminujúcich zložiek: Tlmivý roztok s etanolom odstráni nežiadúce

bunkové zvyšky, soľné prímesi a zároveň vyčistí naviazanú DNA na kolónke.

4. Elúcia DNA z kolónky: podľa typu živice dosiahne sa alkalickým tlmivým roztokom alebo roztokom

s vysokou koncentráciou soli. Výťažok býva cca 10

µg DNA/0,2 ml krvi.

ELEKTROFORETICKÉ METÓDY (ELFO)

Princíp elektroforézy: Molekuly nukleových kyselín (DNA aj RNA) sa v elektrickom poli delia na základe ich náboja.
Všeobecne sa pri ELFO využíva schopnosť nabitých častíc pohybovať sa v elektrickom poli ku opačne nabitým
elektródam. Katióny sa pohybujú ku záporne nabitej elektróde katóde(-) a anióny ku kladne nabitej elektróde anóde (+).
Za fyziologických podmienok sú fosfátové skupiny nukleových kyselín ionizované, molekuly sa správajú ako
polyanióny a v elektrickom poli sa pohybujú ku (+) anóde.
Nosiče – gély ako sú agaróza a polyakrylamid výrazne zvyšujú viskozitu ELFO prostredia, úmerne ich koncentrácii
a stupňu zosieťovania. Gély vytvárajú zosieťované štruktúry s malými pórmi a voľnými poliami, ktoré sú vyplnené
tlmivým roztokom.
Agaróza je polysacharid, ktorej základná jednotka je agarobióza.

Pohyblivosť molekúl DNA v géli bude prakticky závisieť od veľkosti molekúl a ich konformácie, koncentrácii agarózy,
napätia a charakteru tlmivého roztoku.

Hustota gélu: Agarózové gély sa bežne používajú vo výslednej koncentrácii agarózy 0,5 až 3,0 %. Možno na nich
dosiahnuť efektívne rozdelenie fragmentov obsahujúcich desiatky až 10 000 bp. V prípade, že je potrebné dosiahnuť
rozdelenie malých fragmentov DNA a odlíšiť rozdiel vo veľkosti 1 bp použijú sa gély až s 20% koncentráciou
polyakrylamidu.

Tlmivé roztoky: používajú sa mierne alkalické tlmivé roztoky (pH – 8,0) z dôvodu zlepšenia ionizácie fosfátových
skupín. Bežne používaný je Tris-acetátový (TAE), Tris-borátový (TBE) a Tris-fosfátový (TPE) tlmivý roztok.

Vizualizácia DNA v géli: Používajú sa tzv. interkalačné farbivá, ktoré sa viažu s prítomnými bázami. Najčastejšie
používané farbivá sú etidíumbromid a SYBR Green. Vizualizácia fragmentov sa dosiahne pri použití etídiumbromidu pri
UV svetle 300 až 360 nm. Veľkosť fragmentov sa vyhodnocuje pomocou štandardy - zmes fragmentov DNA o známej
dĺžke

DENATURAČNÁ GRADIENTOVÁ GÉLOVÁ ELEKTROFORÉZA (DGGE)

Denaturačná gradientová elektroforéza umožňuje rozlíšiť rozdiel sekvencie iba jednej bázy u kratších fragmentov DNA.
Počas elektroforézy sa vzorka DNA pohybuje v géli, ktorý obsahuje vzrastajúcu koncentráciu denaturačného činidla
(urea, formamid). Metóda má nenahraditeľný význam pri odhaľovaní bodových mutácii a polymorfizmov (single
nukleotide substitution, polymorphism - SNS a SNP) teda tam, kde sa nemení dĺžka DNA. Uvedená metóda môže byť
nahradená metódou pri ktorej sa vzorky najskôr denaturujú a potom sa delia jednovláknové úseky denaturovanej DNA.
Elektroforéza prebieha v polyakrylamidovom géli. Pri zámene nukleotidu sa zmení pohyblivosť vlákna v dôsledku
rozdielnych konformačných zmien, čo možno danou metódou odhaliť.

lýza bunkových membrán

zachytenie DNA na membránu kolónky

1. premytie DNA a odstránenie
kontaminujúcich zložiek

2. premytie DNA

vysušenie kolónky s DNA

elúcia DNA do sterilnej vody

Prevzaté od: Clark (citácia č.1 z postru C1)

štart

s

m

e

r p

oh
y

b

u

D

N

A

v

e

le

k

tro

fo

ré

ze

A

B

C

štandard

700 bp

500

400
300

200

150

100

75

50

25

-

+

+ fenol

pretrepať

centrifugácia

DNA, RNA,
proteíny vo
vodnej fáze

DNA a RNA

vo vodnej

fáze

Proteíny vo

organickej

fáze

fenolová

vrstva

+ fenol

pretrepať

centrifugácia

DNA, RNA,
proteíny vo
vodnej fáze

DNA a RNA

vo vodnej

fáze

Proteíny vo

organickej

fáze

fenolová

vrstva

+ fenol

pretrepať

DNA, RNA,
proteíny vo
vodnej fáze

DNA a RNA

vo vodnej

fáze

Proteíny vo

organickej

fáze

fenolová

vrstva

centrifugácia

Foto agarózového gélu, DNA je vizualizovaná etídium bromidom pod UV lampou
pri 360 nm. V dráhe 1. veľkostný štandard, v ďalších dráhach sú vzorky DNA
(fragmenty) rozdelené podľa ich molekulovej hmotnosti.

Schematické znázornenie elektroforézy v agarózovom gély. Smer pohybu DNA v
elektroforéze ukazuje šípka na obrázku. V prvej dráhe je veľkostný štandard, v
ďalších dráhach sú vzorky DNA s rôzne dlhými fragmentami, ktoré sú rozdelené
podľa ich molekulovej hmotnosti.

Kolónková izolácia DNA, na obrázku sú znázornené jednotlivé kroky samotnej
izolácie až po uvoľnenie DNA z membrány kolónky.

50

75

100

150

200

224

161

63

štandard

bp

1 2
3