6

PCR je metóda, ktorá umožňuje zmnoženie (amplifikáciu) špecifických úsekov DNA in vitro
polymerizáciou pri využití katalytického účinku špecifického enzýmu DNA-polymerázy.
Zmnoženie DNA sa realizuje cyklickým opakovaním celého procesu (preto označenie reťazová
reakcia). PCR takto imituje prirodzený mechanizmus replikácie DNA, ktorý sa v organizme
uskutočňuje počas každého cyklu delenia bunky.

Takto možno v priebehu pár hodín získať až niekoľkomiliónové zmnoženie akéhokoľvek úseku
DNA, ktorého sekvencia (aspoň oboch koncových oblastí) je známa a ktorého dĺžka nepresahuje
20kb. Táto metóda spôsobila v molekulárnej genetike revolúciu, pretože je geniálne jednoduchá,
veľmi rýchla a citlivá. Po prvýkrát referovali o tejto metóde Mullis a Faloona FA (1987). Specific
synthesis of DNA in vitro via polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155: 335-
350.

PCR – Polymerázová reťazová reakcia
(Polymerase Chain Reaction)

Denaturácia

Denaturá

– oddelenie obidvoch komplementárnych reťazcov daného úseku DNA zohriatím na

94

°C

Hybridizácia

Hybridizá

– naviazanie dvoch komplementárnych primerov (štartéry - oligonukleotidy 18-25bp

ohraničujúce amplifikovaný úsek DNA) po jednom na 3´- koniec oboch reťazcov úseku, ktorý má
byť amplifikovaný; hybridizácia prebieha pri teplote 50-60

°C

Polymerizácia

Polymerizá

– syntéza chýbajúceho komplementárneho úseku DNA – jej začiatok predstavujú

primery, od ktorých sa vlastná syntéza odvíja pripájaním jednotlivých komplementárných
nukleotidov: prekurzory DNA (4-deoxynukleozidtrifosfáty dATP, dCTP, dGTP, dTTP), ktoré
predstavujú základné kamene pre syntézu DNA. Je to úloha termostabilnej DNA-polymerázy, ktorá
sama však nemá schopnosť iniciovať syntézu (na to slúžia primery). Syntéza prebieha pri
optimálnej teplote 72

°C. Po skončení syntézy je vytvorená kompletná kópia pôvodného

dvojvláknového úseku DNA, ohraničeného primermi. Zmnoženie sa uskutočňuje exponenciálnym
radom (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256... 1 073 741 824).

Princíp DNA amplifikácie spočíva v cyklickom opakovaní troch krokov:

1.krok:

Denaturácia

2. krok:

Hybridizácia

primerov

3. krok:

Polymerizácia

Metódy identifikácie mutácií: PCR – RFLP, AS – PCR, RT – PCR

Niektoré možnosti využitia PCR:

- genetický výskum a klinická genetika (detekcia mutácií a mapovanie génov)

- klinické disciplíny (onkológia, detekcia patogénnych činiteľov a rekombinantné lieky)

- súdne lekárstvo (kriminalistika a identifikácia osôb)

- sporná paternita a identifikácia príbuznosti

- historická antropológia, archeológia a vývojová biológia

PCR – RFLP – Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

PCR - RFLP sa stala štandardnou metódou pri vyšetrovaní vzoriek DNA a pri detekcii mutácií.
Restrikčné endonukleázy (restriktázy) majú významné postavenie v DNA diagnostike mnohých
dedičných ochorení. Restriktázy sú v bakteriálnych bunkách súčasťou restrikčno – modifikačného
systému, ktorý chráni bunku pred vstupom cudzorodej DNA, najčastejšie vírusového pôvodu.
Restriktázy štiepia DNA v špecifických miestach. Rozpoznávacie miesta restriktáz pozostávajú zo
štyroch až ôsmych nukleotidov. Každá restriktáza má svoj kód, ktorý je určený na základe
dohodnutej nomenklatúry zohľadňujúcej rodový a druhový názov organizmu, kmeň
mikroorganizmu a taktiež R-M systém v prípade ak existuje viacero systémov v bunke. HindI je
restriktáza produkovaná baktériou Hemophilus influenzae, kmeňom d a predstavuje R-M I systém.
Prítomnosť špecifických restrikčných miest možno využiť na rýchle, veľmi jednoduché a presné
odhalenie mutácií, v prípadoch, kde je patologický stav podmienený známou mutáciou. Ak bodová
mutácia zruší restrikčné miesto v DNA sekvencii pre danú restriktázu, z dvoch fragmentov vznikne
jeden a naopak, vznik nového restrikčného miesta spôsobí rozdelenie pôvodného fragmentu na
dva. Detekcia mutácie sa teda zakladá na polymorfizme dĺžky restrikčných fragmentov, čo
umožňuje odlíšiť štiepenú alelu od neštiepenej.

Restrikčná analýza mutácie W151X v exóne 6 pri ochorení Smith-Lemli-Opitzov
syndróm.

Bodová mutácia TGG→TAG spôsobí vznik rozpoznávacej sekvencie pre restriktázu AluI,
ktorá rozpoznáva sekvenciu AGCT. Dráha 1: marker molekulovej hmotnosti delený po
50bp, dráhy 2, 3 homozygot pre mutáciu W151X (štiepený fragment 282 bp + 80 bp),
dráhy 4, 5 heterozygot pre mutáciu W151X (štiepený aj neštiepený fragment), dráhy 6, 7
homozygot pre divú alelu (neštiepený fragment 362 bp).

282 bp

362 bp

250 bp

500 bp

7 6 5 4 3 2 1

AS – PCR (ARMS) : Alelovo špecifická PCR

Alelovo špecifická PCR poskytuje informáciu o prítomnosti alebo neprítomnosti mutácie na jednej
alele génu a preto na stanovenie genotypu jedinca je nutné, aby prebehli dve PCR reakcie. Jedna
reakcia slúži na amplifikáciu alely bez mutácie a obsahuje primer špecifický pre štandardnú alelu.
Druhá reakcia obsahuje primer špecifický len pre mutantnú alelu a neamplifikuje štandardnú alelu
génu. Pri AS – PCR sa teda navrhujú dva typy alelovo-špecifických primerov, jeden pre
štandardnú, druhý pre mutantnú alelu. Primery sú sekvenčne identické, odlišujú sa jedine bázou
na 3` terminálnom konci, čím sa zabezpečí preferenčná amplifikácia jednej alely pred druhou. Z
dôvodu vylúčenia nesprávnej genotypizácie v dôsledku zlyhania PCR sa do každej reakcie
pridáva ďalší pár alelovo-nešpecifických primerov pre kontrolnú amplifikáciu.

AS - PCR pri detekcii mutácie L109P (CTT→CCT) v exóne 5 pri ochorení
Smith-Lemli-Opitzov syndróm.

Genotypizácia jedinca je založená na prítomnosti PCR produktu iba v jednej alebo v
obidvoch reakciách. Pacient 1: homozygot pre štandardnú alelu má PCR produkt
prítomný jedine v reakcii slúžiacej na amplifikáciu štandardnej alely génu (dráha 2A,
PCR produkt o dĺžke 202 bp), Pacient 3: homozygot pre danú mutáciu má PCR produkt
v reakcii slúžiacej na amplifikáciu mutantnej alely (dráha 4B, PCR produkt o dĺžke 202
bp), Pacient 2: heterozygot pre danú mutáciu, má PCR produkt v obidvoch reakciách
(dráha 3A a 3B). Kontrolný PCR produkt o dĺžke 250 bp vo všetkých dráhach. 1: marker
molekulovej hmotnosti.

4B 4A 3B 3A 2B 2A 1

500 bp

250 bp

Pacient 3 Pacient 2 Pacient 1

Real – time PCR monitoruje emitovanú fluorescenciu počas PCR reakcie. Zvyšovanie
flourescencie indikuje amplifikáciu DNA v reálnom čase (narozdiel od konvenčnej PCR →
detekuje sa až po skončení reakcie).

RT – PCR : Real – time PCR

Real – time PCR výhody:

• neovplyvňovaná nešpecifickou PCR amplifikáciou

• amplifikácia monitorvaná v reálnom čase

• žiadne post PCR spracovanie (žiadna elektroforéza)

• menšie riziko kontaminácie

• veľmi nízke množstvo templátu (1 kópia génu)

• potvrdenie špecificity amplifikovaného PCR produktu pomocou
melting analýzy (zisťovanie teploty topenia PCR produktu)

• špecifickejšia, senzitívnejšia a reprodukovateľnejšia ako
konvenčná PCR

Základné kroky PCR

T

C

Real-time PCR nevýhody:

• nie je ideálna pre multiplexovanie

• navrhnutie real-time PCR protokolu je komplikovanejšie
ako pri konvenčnej PCR

• cena prístroja je podstatne vyššia ako cykléra pre
konvenčnú PCR

Tri základné metódy – princípy pre kvantitatívnu detekciu :

b. DNA- viažuce agensy: (SYBR Green)

c. Hydrolyzačné próby: (TaqMan, Beacons, Scorpions)

d. Hybridizačné próby: (Light Cycler)

a. SYBR Green

b. Hydrolyzačné próby

c. Hybridizačné próby

Hybridizácia

Elongácia

Koniec PCR

202 bp

250 bp

Série desiatkového riedenia templátu

95 ˚C

+ primery

Syntéza DNA

Amplifikácia

Priebeh
PCR

termocykléry

alela 1 (štandardná)

alela 2 (mutantná)

Tvorba alelovo – špecifických
primerov

Real – time prístroj

5'

3'

Alelovo-špecifický primer pre
štandardnú alelu (1)

5'

3'

Alelovo-špecifický primer pre
mutantnú alelu (2)

T

C

PCR s AS primerom 1 alebo 2 +
spoločný primer

T

5'

3'

alela 1

Spoločný
primer

+

5'

A

5'

3'

T

amplifikácia

A

5'

C

alela sa s daným primerom neamplifikuje

3'

alela 2

C

3'

5'

5'

G

G

5'

5'

3'

3'

C

T

amplifikácia

alela sa s daným primerom neamplifikuje

alela 1

alela 2

Bodová mutácia spôsobí vznik
restrikčného miesta

Štiepenie restrikčnou
endonukleázou

alela 1

alela 2

Elektroforéza a vizualizácia
štiepnych fragmentov

-

+

* Obrázky: www.google.com

*

*

*

Cykly