Elektroforéza

•

fyzikálno-chemická metóda na separáciu látok nesúcich elektrické

náboje

•

látky sa vystavia pôsobeniu elektrického poľa, dochádza k

pohybu molekúl

•

ich pohyblivosť závisí od veľkosti náboja, veľkosti a tvaru molekúl,

podmienok prostredia (napríklad charakter nosiča) a sily

elektrického poľa

•

delenie nukleových kyselín a proteínov

•

pri separácii látok sa používajú ako nosiče najčastejšie agarózové

a polyakrylamidové gély

•

gély majú charakter molekulových sít, čo umožňuje, aby sa pri

elektroforéze rozdelili aj látky, ktoré majú rovnaký náboj, ale

rozličnú veľkosť molekúl

•

podľa príslušného gélu rozlišujeme elektroforézu agarózovú a

polyakrylamidovú (PAGE)

Elektroforéza v agarózovom géli

• separácia a identifikácia NK
• delenie fragmentov DNA s veľkosťou ~ 20 – 20 000 bp s

rozlíšením ~ 5 bp (špeciálne typy agarózy, vo väčšine

prípadov je rozlíšenie viac ako 5 bp)

• molekuly DNA sa pohybujú (DNA je záporne nabitá) v

agarózovom géli od záporne nabitej katódy ku kladne

nabitému pólu (k anóde)

• separujú sa na základe ich veľkosti (bázových párov) –

malé molekuly DNA sa pohybujú rýchlejšie, veľké pomalšie

• agaróza je lineárny polymér D-

galaktózy a galaktózového

derivátu (3,6-anhydro-L-

galaktózy), ktorý sa získava

purifikáciou agaru (výťažok z

červených rias)

• pri príprave gélu sa agaróza

rozpúšťa v horúcich tlmivých

roztokoch (napríklad Tris-

borátový alebo Tris-acetátový

tlmivý roztok)

• ak teplota klesne pod 45 °C,

vzniká polotuhý gél

• základné zariadenie na

elektroforézu sa skladá z

elektroforetickej komory a zdroja

jednosmerného elektrického

prúdu

• elektroforetická komora má

katódový a anódový priestor s

elektrolytom a priestor na

umiestenie nosiča

vzorka DNA sa do gélu
nanáša zmiešaná s farbivom
(brómfenolová modrá,
xyléncyanolová zelená)

• do gélu sa pridáva interkalačné činidlo, ktoré sa

počas migrácie DNA začleňuje medzi dusíkaté bázy

DNA a po elektroforéze umožňuje pozorovanie

jednotlivých fragmentov separovanej DNA v UV

svetle

• vizualizácia DNA – pomocou fluoreskujúceho farbiva

– etídiumbromid (EtBr)

• komplex EtBr s DNA po ožiarení UV lúčmi

fluoreskujú oranžovo

• EtBr sa pridáva do agarózového gélu počas jeho

prípravy

• EtBr je silné mutagénne činidlo, preto pri manipulácii

s gélmi a roztokmi je nevyhnutné použiť rukavice!!!

• veľkosť separovaných DNA fragmentov sa zisťuje porovnaním s

markermi molekulových hmotností - súborom fragmentov DNA so

známou veľkosťou

• v súčasnosti je komerčne dostupných mnoho rozličných markerov,

výber vhodného markera závisí od konkrétnej aplikácie

Rýchlosť pohybu NK v géli závisí od

niekoľkých faktorov:

• veľkosť NK

Menšie molekuly prechádzajú gélom rýchlejšie,

ľahšie sa pohybujú v sieťovitej štruktúre gélu.

Veľkosť jednotlivých prúžkov možno odčítať zo

štandardu molekulových hmotností. Pri začiatku

gélu sa DNA pohybuje pomalšie ako pri jeho

konci, takže vzdialenosti medzi jednotlivými

prúžkami v DNA ladderi nie sú proporcionálne.

• konformácia NK

Sekundárne štruktúry DNA ťažšie prechádzajú

gélom.

• forma NK

Superšpiralizované plazmidy sa pohybujú v géli

pomalšie ako relaxované kruhové formy, pričom

najrýchlejšie sa v géli pohybuje lineárna forma

DNA.

• koncentrácia gélu

Hustejší gél vytvára aj hustejšiu sieťovitú

štruktúru, ktorá sa viac hodí na lepšiu separáciu

menších fragmentov.

• napätie elektroforetickej aparatúry

Čím vyššie je napätie, tým rýchlejšie prebieha

separácia, ale zároveň sa tým uvolňuje viac tepla,

ktoré zohrieva aparatúru a môže interferovať s

delením. Vyššie napätie môže byť aj príčinou

"rozmazaných" prúžkov.

PCR-RFLP

1. ODBER VZORIEK





2. IZOLÁCIA DNA

VZORKA LYZAČNÝ ROZTOK





DNA


3. PCR
CIEĽOVÁ SEKVENCIA
_______________________ TEMPLÁT DNA



MILIÓNY KÓPIÍ
______________ CIEĽOVEJ SEKVENCIE


4. RESTRIKČNÁ ANALÝZA

______________




_____ _________ ______________


5. ELEKTROFORÉZA A VYHODNOTENIE

CYKLER

37°C