Všeobecné vybavenie molekulárneho laboratória

vybavenie molekulárneho laboratóri

Chemické sklo (skúmavky, odmerné valce, kadičky, Erlenmeyerove banky,
reagenčné fľaše a iné) – používajú sa pri príprave roztokov, gélov, kultivačných
médií, ako aj na ich uskladnenie

- v rámci experimentov v molekulárnom laboratóriu sa sklené nádoby využívajú
v oveľa menšej miere ako v chemickom laboratóriu, pretože sú nahradené
kvalitnými sterilnými plastovými nádobami vo váčšine prípadov na jednorázové
použitie

Plastové nádoby a pomôcky

Experimenty v molekulárnej biológii si vyžadujú prácu v sterilných
podmienkach so sterilnými pomôckami. Na zabránenie kontaminácie –
jednorázový materiál vyrobený z kvalitného plastu (napr. polypropylén),
vysoká odolnosť voči chemikáliám a vysokým teplotám, väčšinu z nich je
možné sterilizovať alebo autoklávovať

Skúmavky so šróbovacím uzáverom

Mikroskúmavky (tzv. eppendorfky)

 rôzne objemy – 2,0 ml; 1,5ml; 0,5 ml; 0,2 ml (pri metóde

PCR)

 uzatvárateľné rôznymi typmi uzáverov
 prispôsobené pre centrifugáciu v rôznych typoch centrifúg

PCR Strip Tubes

PCR plate (PCR plát)

PCR Tubes

Špičky s filtrom

Špičky na mikropipety

 rôzny objem podľa použitej mikropipety (objem 1000, 200, 10 l)
 podľa objemu sú špičky aj farebne odlišné (modré 1000l, žlté 200l, biele-

bezfarebné 10

l)

 vzhľadom na odlišnosť mikropipiet od rôznych výrobcov, je potrebné použiť

špičky určené pre konkrétny typ mikropipety

 Vyrobené z kvalitného plastu, sú odolné voči chemikáliám a je možné ich

sterilizovať a autoklávovať

Mechanické pipety s fixným a variabilným objemom
Jednokanálové, Viackanálové
•

fixné pipety s objemom od 10 µl až do 1 000 µl, pipety s variabilným objemom 0,1 µl - 2,5 µl až

po 1 - 10 ml

•

8-kanálové a 12-kanálové pipety o objemoch 0,5 - 10 µl, 10 - 100 µl a 30 - 300 µl

•

Autoklávovateľné, buď celá pipeta alebo len jej spodná časť

•

pipety s variabilným objemom - nastaviteľné pomocou otočnej skrutky

•

separátny vyhadzovač

Mikropipety

• 1-kanálové, 8-kanálové nebo 12 kanálové
• zobrazovací displej
• pracovné režimy: pipetovanie, opakované dávkovanie – nasaje plný

objem špičky a dávkuje užívateľom nastavený objem, možnosť

premiešania vzorky po vypustení do skúmavky, nastaviteľná rýchlosť

nasávánia i vypúšťania

• možnosť pripojenia k PC a vytvorenia vlastných pracovných režimov

pomocou ovládacieho softwéru

Elektronické pipety

Zásady pipetovania

• Nenastaviť objem pod 0l alebo nad maximálny objem mikropipety,

inak dochádza k jej poškodeniu a chybe merania

• Kvapalina sa pri pipetovaní prenáša v plastovej špičke (Nikdy

nezabudnúť ju nasadiť!!!, inak skontaminujeme alebo poškodíme

piest pipety)

• Nasávanie a vypúšťanie realizujeme stláčaním a uvoľnením piestu

pipety – piest stlačíme do prvej polohy a špičku ponoríme do kvapaliny,

uvoľnením uvedieme piest do pokojovej polohy za súčasného naberania

kvapaliny do špičky (ubezpečíme sa, že v kvapaline v špičke nie sú

vzduchové bubliny), pipetu so špičkou vyberieme a vložíme do novej

skúmavky, kde vypustíme celý obsah špičky stlačením piestu

Pozor! Kapilárne javy v špičke spôsobia, že sa celý objem kvapaliny nevytlačí,

preto stlačíme piest až na doraz (do druhej polohy)

 Špičku z pipety odstránime použitím „vyhadzovača“
 Špičku vždy meníme!!! – je jednorázová

Centrifugácia

•

Separačná metóda založená na rozdielnom pohybe častíc v tekutom prostredí
vplyvom odstredivej sily

•

Odstredivé pole vzniká otáčaním rotora centrifúgy, pohyb častíc je
podmienený hmotnosťou a prostredím

•

Využíva sa napr. pri izolácii, purifikácii (prečisťovaní) DNA, RNA a proteínov

•

Rýchlosť centrifugácie závisí od veľkosti častíc, ktoré separujeme a od
metódy, vyjadruje sa pomocou jednotky otáčky za minútu (ot/min., rpm)

2 typy centrifugácie :
Diferenciálna (frakčná) – je možné oddeliť zmes častíc, ktoré sa výrazne líšia
veľkosťou, hmotnosťou alebo hustotou. Prebieha v homogénnom roztoku. Zložky
zmesi sedimentujú rôznou rýchlosťou. Častice s najväčšou hmotnosťou alebo
veľkosťou po centrifugácii vytvoria zónu na dne skúmavky, ďalšie častice tvoria
ďalšie zóny smerom k ústiu skúmavky podľa klesajúcej hmotnosti. Využitie – na
separáciu a izoláciu zložiek lyzátov z buniek.

Zonálna (gradientová) – používa sa, ak zmes na separáciu pozostáva z
častíc, ktorých rýchlosť sedimentácie je veľmi podobná (rôzne typy nukleových
kyselín). Používa sa gradientový roztok (sacharóza, CsCl), ktorého
koncentrácia od povrchu ku dnu skúmavky stúpa. Čistota preparátov je vysoká.

Zásady centrifugácie :
 skúmavky v rotore musia byť vyvážené – vždy umiestňujeme skúmavky s

rovnakou

hmotnosťou oproti sebe
 Manipuláciu so skúmavkami v centrifúge uskutočňujeme len vtedy, ak nie je
centrifúga v činnosti
 Centrifugáciu spustíme až vtedy, keď je veko centrifúgy bezpečne

zatvorené; veko otvoríme až po zastavení rotora

 Používame len skúmavky odporúčané výrobcom centrifúgy

Rôzne typy centrifúg s rôznymi rotormi

Typ rotora centrifúgy

Sterilizácia

pomôcok a priestorov

Pri práci s NK je riziko kontaminácie veľmi vysoké, môže dôjsť ku kontaminácii

vzoriek cudzorodou DNA (napr. pri práci s ľudskou DNA je možná

kontaminácia s DNA experimentátora) alebo sa kontaminujú vzorky

navzájom. Zvlášť vysoké riziko nastáva počas metódy PCR.

Opatrenia: jednorázový materiál, sterilizácia priestorov a materiálu, ochranný

odev

• použitie UV svetla

– degraduje molekuly NK a eliminuje prítomné

baktérie (špeciálne boxy s UV lampou a laminárnym prúdením vzduchu –

pri otvorení boxu zabraňuje výmene vzduchu medzi boxom a okolím)

• pomocou autoklávu – sterilizácia sa dosahuje pôsobením nasýtenej

vodnej pary pri vysokej teplote a tlaku (najčastejšie pri 120°C, pri tlaku 0,1-

0,3 MPa, 20 min.) (plasty, sklo), je možné autoklávovať aj roztoky (zásady-

množstvo roztoku nesmie presiahnuť 2/3 objemu nádoby, vrchnák nádoby

nechať nasadený len voľne

• pomocou sterilizátora – pôsobením vysokej teploty, menej účinná

ako sterilizácia v autokláve

Tlmivé roztoky (pufre, angl. buffers)

• Udržujú pH roztoku konštantné aj po pridaní malého množstva

kyselín alebo zásad

• Ph tlmivého roztoku sa nemení ani zriedením roztoku
• Využívajú sa pri práci s enzýmami, pri elektroforéze, izolácii a

purifikácii biologicky aktívnych látok

• tlmivé roztoky pre prácu s enzýmami majú rôzne zloženie, sú

komerčne dodávané s konkrétnym enzýmom

Izolácia

DNA

Cieľ: získať čistú, vysokomolekulárnu DNA bez proteínov a

polysacharidov

 vzhľadom na veľkosť DNA v jednotlivých chromozómoch

eukaryotických organizmov (desiatky miliónov báz), je
technicky veľmi náročné izolovať neporušené molekuly
DNA v plnej dĺžke a manipulovať s nimi v in vitro
podmienkach.

 Pre väčšinu experimentov to však ani nie je potrebné a

úplne postačujúca je fragmentovaná DNA s dĺžkou
fragmentov 70-150 kb.

 V súčasnosti existuje množstvo metodík izolácie

nukleových kyselín z rôznych zdrojov.

 Mnohí výrobcovia dodávajú celé súpravy chemikálií (tzv.

kity) určené pre izoláciu DNA z konkrétneho zdroja s

vysokou účinnosťou.

 DNA sa izoluje z krvi, z chlpovej cibuľky, buniek sliznice

ústnej dutiny, prípadne zo svalu alebo iných tkanív.

 DNA z rastlinných pletív sa izoluje ťažšie v porovnaní so

živočíšnymi tkanivami vďaka pevnej bunkovej stene. Na

jej rozrušenie sa používajú rôzne zmesi enzýmov

(izolované napr. z Trichoderma reesei) alebo sa bunková

stena rozruší pomocou tekutého dusíka

Všetky metódy izolácie genómovej DNA z tkanív

živočíchov a pletív rastlín sú založené na základných

krokoch:

• 1. homogenizácia (rozrušenie tkanív, pletív a čiastočne i

buniek)

• 2. lýza buniek a bunkových membrán
• 3. uvoľnenie väzby medzi DNA a bielkovinou (rozpad

nukleoproteínového komplexu)

• 4. odstránenie proteínov a ostatných

vysokomolekulárnych zložiek bunky okrem DNA,

prečistenie DNA od nežiaducich prímesí (tzv. čistenie -

purifikácia DNA)

• 5. vyzrážanie DNA (precipitácia)

1. rozrušenie tkanív

v homogenizátore v prostredí zvoleného extrakčného média, v
niektorých prípadoch – pri tkanivách s vysokou aktivitou nukleáz
alebo pri pevnejších tkanivách (kostné tkanivo) – je vhodné tkanivo
zmraziť v kvapalnom dusíku, rozdrviť na prášok

2. rozrušenie buniek (bunkových membrán)

pomocou lyzačného roztoku (Tris- HCl pH=7.5, EDTA, aniónové
detergenty – laurylsíran sodný, lítny alebo SDS (soľ
dodecylsulfátu))

Aktivita nukleáz – enzýmov, ktoré sa prirodzene vyskytujú v bunkách a

degradujú DNA sa inhibuje :

 roztokom EDTA - viaže ióny (napríklad Mg2+), ktoré nukleázy

vyžadujú ku svojej aktivite

 teplotou až 60°C v prítomnosti detergentov (SDS)

3. uvoľnenie väzby medzi DNA a bielkovinou

DNA tvorí pevné komplexy s histónmi a ďalšími

proteínmi, preto sa do lyzačného roztoku pridáva enzým

proteináza K a detergenty (SDS alebo N-lauryl sarkozín),

ktoré pomáhajú deproteinizácii

(proteináza K - izolovaná z baktérie Tritirachium album -

štiepi peptidové väzby po karboxylovej skupine N-

substituovaných aminokyselín, čím hydrolyzuje proteíny)

4. deproteinizácia preparátov DNA (odstránenie proteínov z

roztoku)
prečistenie preparátov DNA od bielkovinových prímesí
sa dá uskutočniť viacerými postupmi, v ktorých použité
činidlá denaturujú prítomné bielkoviny a DNA ostane
rozpustená vo vodnej fáze bez toho, aby sa porušila ich
štruktúra

A) fenol alebo zmes fenol:chloroform - najefektívnejšie
denaturačné činidlá. Nevýhodou fenolu je jeho vysoká
toxicita.
B) vysoľovanie pomocou NaCl

A) Nukleové kyseliny sú hydrofilné molekuly, ktoré sa dobre rozpúšťajú vo vodnej

fáze. Bielkoviny vďaka prítomnosti hydrofóbnych skupín sú lepšie rozpustné v
organickej vrstve (spodná). Po intenzívnom pretrepaní sa vzorka centrifuguje a
vytvoria sa dve fázy. Vrchná vodná fáza obsahuje rozpustené nukleové
kyseliny, medzifáza je tvorená denaturovanými proteínmi a zbytkami buniek, v
hornej vodnej fáze je rozpustená DNA.

Na odstránenie zvyškov fenolu sa využíva zmes chloroformu s izoamylalkoholom v pomere 24 :

1. Chloroform tiež denaturuje bielkoviny, izoamylalkohol znižuje penenie zmesi, uľahčuje
oddelenie vrstiev pri centrifugácii a udržuje ich stabilitu.

B) po centrifugácii získame v spodnej fáze tvorenej NaCl denaturované proteíny a v

hornej vodnej fáze rozpustenú DNA

5. vyzrážanie DNA
- najčastejšie 96% etanolom alebo izopropanolom
- účinnému vyzrážaniu DNA sa pomáha znížením teploty a pridaním soli

IZOLÁCIA DNA POMOCOU KOLÓN

Princíp metódy je založený na zachytení DNA na kolónkach, ktoré obsahujú
silikagély alebo anión iontomeničové živice. Na izoláciu stačí 0,2 ml nezrazenej
krvi.

1. Rozbitie buniek: proteináza K narušuje bunkové steny a napomáha
rozrušenie buniek. Lyzačný roztok, obsahujúci chaotropné soli a detergent
rozbíja otvorené bunky. Intenzívne premiešanie a teplota 65 °C napomáhajú
lýze membrán a natráveniu bielkovín.

2. Zachytenie DNA na membráne kolónky: DNA sa viaže na kremičitú
membránu kolónky, nežiadúci bunkový materiál, denaturované proteíny a RNA
sa odstránia pretečením kolónkou.

3. Premývanie a odstránenie kontaminujúcich zložiek: Tlmivý roztok s etanolom
odstráni nežiadúce bunkové zvyšky, soľné prímesi a zároveň vyčistí naviazanú
DNA na kolónke.

4. Elúcia DNA z kolónky: podľa typu živice dosiahne sa alkalickým tlmivým
roztokom alebo roztokom s vysokou koncentráciou soli. Výťažok býva cca 10
mg DNA/0,2 ml krvi.