2005

Katedra molekulárnej biológie

Základné metódy práce

Základné metódy p

s ľudskou DNA

Izolácia DNA

DNA - v jadre bunky

- v komplexe s bielkovinami

Postup:
1.

lýza bunkových membrán (SDS)

2.

štiepenie proteínov (proteináza K)

3.

odstránenie proteínov

(fenol/chloroform)

4.

vyzrážanie DNA (etanol)

Postup:

Post

1.

lýza bunkových membrán a

lýza bunkových membrán a

štiepenie proteínov

štiepenie prot

2.

naviazanie DNA na kolónu

naviazanie DNA na kol

3.

premytie kolóny

premytie kol

4.

elúcia DNA

elúcia DN

5.

precipitácia DNA

precipitácia DN

Izolácia DNA kitom

Určovanie kvantity a kvality DNA

Spektrofotometricky
1.

kvantita – OD pri 260 nm (1 OD ~ koncentrácia 50 μg/ml)

2.

kvalita – pomer OD pri 260/28nm (ideálne ~ 1,8)

Elektroforézou
1.

kvantita – porovnaním so štandardom

2.

kvalita – určenie degradácie DNA

Elektroforéza DNA

Separačné média pre analýzu DNA

Agaróza

separácia dvojvláknovej DNA

rozdiel vo veľkosti fragmentov

od 10nt

Koncentrácia

agarózy

[%]

Oblasť

efektívneho

rozdelenia

molekúl DNA

[kb]

0,3

60 - 5

0,6

20 - 1

0,7

10 - 0,8

0,9

7 - 0,5

1,2

6 - 0,4

2,0

3 - 0,1

Koncentrácia

polyakrylamidu

[%]

Veľkosť DNA

fragmentov v nt

3,5

1000 - 2000

5

80 – 500

8

60 – 400

12

40 – 200

15

25 – 150

20

6 - 100

Polyakrylamid
Separácia jednovláknovej a
dvojvláknovej DNA
rozdiel vo veľkosti fragmentov od 1 nt

Vizualizácia DNA v géli

EtBr, SYBR Green (agarózový gél,

polyakrylamnidový gél)

–

interkalačné činidlo

–

dsDNA

–

UV lampa

AgNO

3 (polyakrlylamidový gél)

–

ssDNA a dsDNA

–

denné svetlo

Fluorescenčné farbičky (genetický analyzátor)

–

kovalentná väzba farbičky na primer

–

ssDNA

–

laser a CCD kamera

Štiepenie DNA restrikčnými

endonukleázami

enzýmy súčasťou RM systému baktérií
názvy podľa pôvodu
5´prečnievajúce konce, 3´prečnievajúce konce, tupé konce

Elektroforéza DNA po štiepení RE

Príprava rekombinantných DNA

Hybridizácia DNA

komplementarita báz
Tm (GC content)

Southernov blotting

genomická DNA
štiepenie RE
elektroforéza
oligonukleotidová sonda k unikátnej sekvencii

FISH technológia

detekcia numerických a štrukturálnych chromozómových

aberácií
fluorescenčne značené oligonukleotidové sondy
fluorescenčný mikroskop

Microarray/ DNA chip

Hybridizácia fluorescenčne značenej, testovanej DNA

s DNA sondou viazanou na detekčnom sklíčku

DNA microarray a DNA chip

možnosti aplikácie

možnosti aplikáci technológií

tech

DNA microarray a DNA

DNA microar

chip

Polymerázová reťazová reakcia

(PCR)

Kary B. Mullis - 1993 Nobelova cena

Princíp PCR

Verifikácia PCR amplifikácie

PCR odporúčané nastavenie

DNA

–

50 – 500 ng

primery

–

16 – 24 nt dlhé

–

Tm 48 – 65 şC

–

GC content 40 – 60 %

–

1 – 10 pmol/na

reakciu

dNTP

–

50 - 500 μM

MgCl

2

–

1 – 5 mM

DNA polymeráza

–

0,5 – 2,5 U

úvodná denaturácia DNA

94 – 95 şC 2 – 5 min

cyklické opakovanie – 25 - 35 x

denaturácia 94 – 95 şC 30 – 40s

hybridizácia T = Tm – 3 şC

polymerizácia 72şC 45s (do 1 kb)

záverečná polymerizácia

72 şC 7 min

Chladenie/inaktivácia reakcie

4 – 10 şC

Sekvenovanie (Sanger) 1

Sekvenovanie (Cycle sequencing)

Pyrosequencing